新しい写真を使用した 3D バイオプリンティング

npj 再生医療 第 8 巻、記事番号: 18 (2023) この記事を引用

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4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

三次元 (3D) バイオプリンティングは、組織工学において細胞を搭載した構造物を作製するための非常に効果的な技術です。 しかし、細胞含有ヒドロゲルの架橋能力が低いため、正確で複雑な細胞含有ヒドロゲルの作製の多用途性は制限されています。 ここでは、メタクリル化ヒドロゲルを効率的に架橋する光ファイバー支援バイオプリンティング (OAB) プロセスを提案します。 光架橋技術に適切な処理条件を選択することにより、メタクリル化ゼラチン（Gelma）、コラーゲン、脱細胞化細胞外マトリックスなどの生体機能細胞を含む構造体を作製しました。 この方法を骨格筋再生に適用するために、細胞を含むGelmaコンストラクトを、C2C12とヒト脂肪幹細胞（hASC）の一軸整列を誘導できる地形的手がかりとOABプロセスを備えた機能的ノズルで処理しました。 従来の架橋法を使用してプリントされた細胞構築物と比較して、細胞を含むゲルマ構造では、有意に高い程度の細胞整列と筋原性活性が観察されました。 さらに、マウスモデルの体積筋欠損において、生体内再生の可能性が観察されました。 hASCを含む構築物は、地形的手がかりのない細胞構築物よりも、より大きな筋肉再生を有意に誘導した。 この結果に基づいて、新しく設計されたバイオプリンティングプロセスは、さまざまな組織工学用途向けの生体機能細胞を含む構造体の製造において非常に効果的であることが証明される可能性がある。

最近、自然の複雑な組織構造を模倣した細胞搭載足場が、電気流体力学、マイクロ流体、フォトリソグラフィーまたはソフトリソグラフィー、および三次元 (3D) バイオプリンティング プロセスなど、さまざまなボトムアップ法を使用して製造されています。 4,5。 多層技術によって実証された効率的な生産能力のおかげで、3D バイオプリンティングプロセスは組織工学用途に広く採用されています。 特に、さまざまなバイオインクの多彩な用途が大幅に研究されています6、7、8、9。

これまでに、バイオプリンティングを使用せずに機能が改善された組織工学的に作製された骨格筋の開発において、多くの有望な結果が得られてきました10,11。 しかし、バイオプリンティングを行わずに組織工学的に作製された骨格筋構築物の顕著な欠点は、患者固有の形状を作製するのが不十分であることである。 この問題を克服するには、印刷温度、空気圧、印刷速度、印刷された細胞の高い細胞生存率/増殖や表現型の分化/成熟など、適切な生物学的活性を備えた 3D 細胞構築物を作製するための架橋プロセスなどのさまざまなパラメーターを考慮する必要があります。 。

しかし、ノズルベースの押出プロセスには、ストラットサイズの解像度の制限、細胞を装填したストラットの細胞密度の抑制、細胞を装填したヒドロゲルの弱い機械的性質に起因する印刷適性の低さなど、いくつかの欠点があります。 細胞構築物を得るために、イオンと結合したいくつかの先進的なバイオインクが導入されています。 しかし、3D プリンティング技術を使用した機械的に安定した細胞搭載構造の製造は、プリンティング技術とバイオインク形成プロセスにおいて克服すべき課題として残っています 8,12,13。

最近、3D プリンティングプロセスを使用して得られる細胞を含むストラットの欠点を克服するために、印刷と組み合わせた in situ 光架橋プロセスを含むいくつかの架橋戦略が提案されています 8、14、15。 たとえば、機械的に安定したマイクロスケールの細胞を搭載したフィラメントを製造するには、コア/シェル ノズル システムを採用する印刷プロセスが必要です。このシステムでは、シェル領域のアルギン酸塩バイオインクが、光架橋された細胞を搭載したメタクリル化ゼラチンを保護する塩化カルシウム溶液で直ちに架橋されます。 （ゲルマ）コア内16,17。 さらに、同様の研究により、コア内に内皮細胞を含むゲルマが設計されたマイクロ流体チャネルを使用して、細胞を含むコア（ゲルマ）/シェル（アルギン酸ナトリウム）繊維が作製されている18。 さらに、バイオインクの粘度に依存せずに安定した印刷構造（マイクロスケールの格子や中空チューブ）を得るために、3D プリンターに接続された透明なキャピラリー同軸ノズルを使用したその場架橋法が導入されています8。

提案された印刷プロセスは、実際の繊維組織の固有の形態および生体機能を模倣する細胞を含んだ 3D 微小繊維構造を取得するという高度な結果を明確に実証しました。 ただし、この方法では、細胞に充填された生理活性物質をサポートするために、限られたバイオインク（つまり、カルシウムイオン中で急速に架橋可能なアルギン酸塩の使用）を使用します。 さらに、その場で光架橋可能なシステムの場合、流動するメタクリル化細胞を含むハイドロゲルのシェル領域がほとんど光架橋されていないため、現実的な多層 3D 構造を容易に得ることができず、特に透明で疎水性のノズルが必要です。

以前の印刷システムが直面したこれらの課題に対処するために、機械的に安定した構造と現実的な多層細胞装填構造を製造するための印刷プロセスと組み合わせた新しい光架橋戦略を提案します。 そのために、一般的な印刷ノズル内に埋め込まれた光ファイバーを使用して、流動するメタクリル化ハイドロゲル（メタクリル化ゼラチン、コラーゲン、脱細胞化細胞外マトリックス（dECM））を安定に光架橋しました。 このユニークな架橋システムを使用して、機械的に安定で生物学的に安全な細胞を搭載したストラットと、細胞を搭載したフィラメント間に適度な接着力を持って構築された多層の 3D 細胞を搭載した構造が効果的に作製されました。 光架橋プロセスの多用途性を応用するために、C2C12 と表面溝付きプラスチック ノズルで処理されたヒト脂肪幹細胞 (hASC) を使用して、表面微細パターン化された細胞を含むストラットが筋組織再生用に作製されました。 一軸性の溝のある表面パターンを備えた細胞構築物は、ノズルの溝のある表面とその場での光ファイバー支援架橋プロセスの組み合わせによって達成される細胞の整列により、筋原性分化の強化を示しました。 さらに、バイオプリンティングされた hASC 構築物は、マウスの体積筋欠損損傷に適用され、従来のバイオプリンティング プロセスを使用して作製されたものと比較して、筋肉の再生が大幅に強化されることが実証されました。

一般に、ゼラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸、脱細胞化細胞外マトリックスをベースとしたメタクリル化ヒドロゲルなどの光架橋性バイオインクは、優れた細胞封入能力と制御可能な機械的特性により、細胞を搭載した構造物の作製に広く使用されています。さまざまな光架橋プロセスを使用して効果的に達成できます9、19、20、21、22。 光架橋可能なバイオインクを一般的なバイオプリンティングプロセスと組み合わせると、カスタマイズ可能な細孔形状を備えた細胞を含む多層構造物を首尾よく製造できます。 ただし、光架橋プロセスを追加したバイオプリンティングを使用して製造される細胞構築物の正確かつ安定した形成は、採用される架橋アプローチに決定的に依存します。 バイオプリンティングと組み合わせたさまざまな架橋戦略の中で、最も画期的な戦略は、透明な疎水性シリコン ノズルを使用して実行される「その場光架橋法」であり、これにより、流れる光架橋バイオインクのせん断応力を下げることができます8。 バイオインクがノズルを通過するとき、透明なノズルに UV 光を直接照射して、流れる光架橋性の低粘度バイオインクを架橋します。 この方法は、低粘度のバイオインクを効果的かつ安定的に架橋し、機械的に安定した細胞を含むストラットを実現するという点で非常に重要です。 ただし、その場での光架橋プロセスには、特別に設計された透明で疎水性の光透過性ノズルが必要です。 さらに、セルを搭載したストラットの表面は、印刷されたストラットのコア領域よりも積極的に架橋される可能性があるため、3D セル構造を作製した後のストラット間の接着特性が比較的低くなり、結果として 3D 構造の形状形成能力が低下する可能性があります。 。

光架橋性バイオインクの in situ 架橋の欠点を克服するために、in situ 架橋プロセスを使用する従来のバイオプリンティング (CB) とは完全に異なる、光ファイバー支援 3D バイオプリンティング (OAB) プロセスを使用した新しい架橋方法を開発しました (図 1a ～ c​​)。 OAB プロセスのパフォーマンスを評価するために、密度 1 × 107 細胞/mL の C2C12 筋芽細胞を含む光架橋可能な Gelma ベースのバイオインクを選択しました。 これは、Gelma が生体適合性と生分解性の特性を備えた典型的な光架橋性バイオインクと考えられ、組織工学の足場、薬物送達システム、および創傷領域の治癒基質に広く適用できるためです 23,24,25。 バイオインクを効率的に架橋するために、一般的な印刷ノズルに光ファイバーを埋め込み、UV光源（UVスポットヘッド、図1dに示す）の強度を制御することにより、機械的に安定で生物学的に安全な3Dを得ることができました。図1aの光学画像と生（緑）/死滅（赤）画像、および印刷されたゲルマメッシュ構造の光学画像（図1c）に示されているように、細胞を含んだ構造物。 図 1a、c は、ノズル内に挿入された光ファイバーを通して観察された UV 光の光学画像を示しています。 また、光ファイバーによるバイオインクの温度上昇を避けるため、印刷ノズルの周囲に冷却水ジャケット（4℃）を設置しました（図1c、d）。 従来の後架橋と比較して、提案されたOABプロセスは、円形度の値が向上したことで実証されているように、固有の形態を備えた細胞が詰まった3D構造を得ることができます（補足図1）。 さらに、OAB 法は、CB とは対照的に、支柱間の接着力が強化されているため、現実的な多層 3D 構造を製造できます。

プリンターのノズル内に配置された光ファイバーを使用した光支援バイオプリンティングプロセス（OAB）の概略図と、印刷されたC2C12を搭載したゲルマストラットの光学画像およびライブ（緑）/デッド（赤）画像。 b OAB および CB プロセスで処理されたノズル内の光架橋ヒドロゲルの概略図。 c、d 水冷ジャケットに接続された OAB システム、印刷ノズルの断面画像、および印刷されたメッシュセルを搭載したゲルマ構造の光学画像。

Gelma バイオインクの光架橋能力に対する OAB プロセスの影響を観察するために、5 wt% Gelma を使用しました。 図 2a は、UV 暴露 (UV 線量 = 120 mJ/cm2、10 秒間) の前後の時間掃引モードにおける Gelma バイオインクの貯蔵弾性率 (G') を示しています。 予想通り、UV 光に曝露されたジェルマの剛性は、UV 曝露後に大幅に強化されました。

a 5 wt% Gelma の貯蔵弾性率 (G') は、UV 暴露 (UV 線量 = 120 mJ/cm2、10 秒間) の前後に実施された時間掃引試験から得られます。 b 5 wt% のゲルマとフェノールレッドの混合物のさまざまな UV 線量での色の変化。 c 従来のバイオプリンティング（CB）およびOABプロセスを使用して製造された印刷されたゲルマ/フェノールレッドストラットの断面光学画像、半径の断面画像を使用したグレー値の分布、および中心でのグレー値の差およびエッジ領域。 d 構造の安定性を示すために、その場印刷後、振盪中、および振盪後の印刷されたゲルマメッシュ構造の光学画像。 e CB および OAB で処理された印刷メッシュ構造のせん断試験により、ストラット間の接着特性を観察します。 f 印刷されたゲルマ構造の引張応力 - ひずみ曲線とヤング率。 すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 p 値は、スチューデントの t 検定によって計算されました (n = 3/グループ; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)。 スケールバー、200 μm (c)。 1 mm (d)。

ゲルマストラットの断面積にわたる架橋分布に対するノズルの内部に配置された光ファイバーによって生成される光架橋の影響を観察するために、フェノールレッドの赤色強度の分布を測定しました。光架橋度によって異なります。 図 2b は、異なる UV 線量 (0、60、および 120 mJ/cm2) での 5 wt% ゲルマ/フェノールレッド (150 mg/L) の混合物のさまざまな赤色強度を示しており、赤色が退色している​​ことがわかります。紫外線量が増えると白色になります。 図 2c は、それぞれ CB プロセスと OAB プロセスを使用して架橋された Gelma ストラットの 2 つの断面画像を示しています。 印刷/架橋プロセスでは、印刷ノズルのサイズ、ノズル速度、空気圧、および UV 照射量は、それぞれ 700 μm、1 mm/s、120 ± 10 kPa、および 120 mJ/cm2 でした。

CB法およびOAB法を使用して製造された光架橋ゼラチン支柱の赤色の分布を図2cに示します。 結果に示されているように、光架橋の程度を示す灰色の断面分布は方法ごとに異なりました。 CB プロセスの場合、ゲルマ ストラットの断面領域の相対的な灰色の分布は半径で同様でしたが、OAB で処理されたゲルマ ストラットの場合、光架橋はシェルよりもコア領域で相対的に高かったです。領域（図2cのグレー値の差のグラフ）。 これらの結果から、ストラットのシェル領域の比較的低い架橋度が多層プリントフィラメントの 3D 構造形成に影響を与える可能性があることが予想できます。 図 2d は、CB および OAB プロセス (5 wt% Gelma、UV 線量 = 120 mJ/cm2、ノズル サイズ = 700 μm、ノズル移動速度 = 2 mm/s、および空気圧 = 120 ± 10 kPa) を使用して製造された印刷メッシュ構造を示しています。 ）。 ゲルマ構造を作製した後、印刷された構造を振動させた。 光学画像に見られるように、CBプロセスで作製したゲルマストラットでは3Dメッシュ構造が破壊されているのに対し、OABプロセスで作製したゲルマメッシュ構造は元の設計形状を安定に維持していることが分かりました。 この結果は、OAB プロセスを使用して印刷されたゼラチン支柱が互いによく接着し、3D 構造形状を維持していることを示しています。

ゲルマストラット間の接着力を評価するために、せん断試験の変位対荷重を測定しました（図2e）。 その結果、OAB プロセスを使用して製造されたゲルマ ストラット間の接着エネルギーとゲルマ ストラット間の界面力の最大荷重は、CB プロセスを使用して加工されたゲルマ ストラットのものよりも大幅に高かった。 これは、OAB プロセスで印刷された多層ストラットからなる 3D 構造形成が、CB プロセスで印刷されたものよりもはるかに効率的に得られることを示しました。 ただし、引張応力-ひずみ曲線では、CBで処理された構造は、OABを使用して印刷された構造よりも大幅に高いヤング率を示しました（図2f）。 図 2c に示すように、引張弾性率の違いは、ストラット内の架橋の均一性の程度の違いに起因すると考えられます。 OAB プロセスで架橋されたゲルマ ストラットの場合、外部から加えられた引張応力がストラットの比較的低い架橋領域に集中する可能性があり、CB で処理された均一に架橋されたゲルマ ストラットと比較して引張力の抵抗が低くなります。

固定ゲルマ重量分率 (5 wt%) および印刷条件 (ノズル サイズ = 700 μm、ノズル移動速度 = 1 mm/s、および空気圧 = 120) の下で、印刷パラメーター (UV 線量および処理温度) の適切な範囲を決定します。 ±10 kPa)、単一ラインテストを実行しました。

まず、さまざまな UV 線量 (30、90、および 150 mJ/cm2) の下で温度および時間掃引中の 5 wt% Gelma バイオインクのレオロジー特性を測定しました。 予想どおり、温度スイープに対する Gelma バイオインクは、典型的なゾル - ゲル転移挙動を示しました (図 3a)。 さらに、一定温度（10℃）でのUV線量の増加により、Gelmaバイオインクの架橋度が増加しました（図3b）。

5 wt% Gelma のレオロジー特性は、(a) 温度掃引および (b) さまざまな UV 線量での時間掃引によって得られます。 c 印刷されたゲルマストラットの架橋度（架橋なし、不十分な架橋、安定した架橋）に対する処理温度と UV 線量の影響を示すプロセス図。 d さまざまなUV線量（0、90、および120 mJ / cm2）でOABを介して処理されたGelmaストラットの印刷された形状の光学画像、および培養7日目の印刷されたストラットの光学画像。 e さまざまな UV 線量に対するダイスウェル率 (印刷されたストラットの直径/ノズルの直径)。 f 印刷されたゲルマストラットの劣化は、7 日間の培養の前後に観察された直径の差を使用して決定されました。 スケールバー、1 mm (d-ストラット)。 500 μm (培養後)。

光架橋度に対する Gelma バイオインクの温度の影響を観察するために、(1) ゲル領域: 10 °C、(2) ゲル - ゾル転移領域: 20 °C、および ( 3) ゾル領域: さまざまな UV 線量 (0 ～ 150 mJ/cm2) に対して 30 °C。 ゾル領域の温度 (30 °C) では、適用した UV 線量 (0 ～ 150 mJ/cm2) に関係なく、印刷されたゲルマ ストラットの安定した光架橋は得られませんでしたが、ゲルおよびゲル - ゾルで印刷されたゲルマ ストラットの場合は、転移温度および60 mJ/cm2を超えるUV線量により、架橋ゲルマストラットが安定して形成されました（図3c）。 Gelma バイオインクのさまざまなゾルゲル温度に対する光架橋度は、Chansoria らによって行われた研究で報告されたものと一致していました 26。 彼らの研究によると、Gelma バイオインクの圧縮弾性率は、UV 曝露条件だけでなく、光架橋温度にも大きく依存していました。 弾性率は、Gelma のより低い架橋温度 (ゲル温度、10 °C) で増加しました。 この結果は、低温でのゲルマ溶液の光架橋が、低温での緊密に絡み合ったポリペプチドネットワークと共有結合による光架橋の相乗効果を誘発する可能性があるために得られたものである26。

さらに、光架橋/印刷後の構造安定性を実証するために、ダイスウェル比 (D1/D0、D0 と D1 はそれぞれ内側ノズルの直径とノズル先端のストラット直径を示します) とPBS 溶液中で 7 日間放置した後の Gelma ストラットの断面積の変化。 図3dおよび補足図2aは、固定印刷温度（10°C）およびさまざまなUV線量（0〜120 mJ/cm2）での印刷ノズル近くの印刷されたゲルマストラットの光学画像を示しています。 0および30 mJ/cm2のUV線量に曝露されたGelmaの架橋度は低いため、膨潤率は、より高いUV線量（90および150 mJ/cm2）で架橋された印刷されたGelmaの膨潤率よりも大幅に高かった（図3e）。 。 さらに、押し出されたストラットの真円度は120 mJ/cm2まで大幅に増加しましたが、UV線量のさらなる増加は真円度に影響を与えませんでした（補足図2b）。 さらに、固定 UV 線量 (120 mJ/cm2) を使用して、流速 (補足図 2c、d) と光ファイバーからノズル出口までの距離 (補足図 2e、f) を調査しました。 その結果、流速は押し出されたストラットの真円度にほとんど影響しませんでしたが、光ファイバーとノズルの距離の増加により真円度が改善されました。 同様の結果が、Gelma ストラットの劣化挙動 (=[A0 − A1]/A0、A0 と A1 はそれぞれ現場印刷されたストラットの断面積と 7 日後のストラットの面積を表す) でも観察されました。 (図3f)。 90 mJ/cm2 未満の UV 線量では、架橋度が不十分なため、ストラットの劣化が非常に早くなりました。 ストラットの形成と寸法を使用して得られた結果に基づいて、UV 線量 (120 mJ/cm2) の適切な設定を選択できました。

UV線量を固定した後、補足図3a、bに示すように、さまざまなウォータージャケット温度（4、10、および20°C）を調査しました。 その結果、真円度と表面平滑度を用いて測定した押出ストラットの均質性から、比較的低いウォータージャケット温度（4℃）で加工したストラットは、他の温度に比べて有意に高い真円度と平滑な表面を示したことが分かりました。 これは、低温での Gelma の同時 UV 架橋が表現的な構造安定性を誘導できることに起因すると考えられます 27,28。 また、ウォータージャケット温度を4℃に設定した場合の印刷温度は10℃と測定されました。 UV 線量と印刷温度を固定した後、Gelma の重量分率が架橋度に及ぼす影響を観察しました。 補足の図 4a、b は、Gelma バイオインクの 3 つの重量分率 (3、5、および 7 wt.%) の貯蔵弾性率を示しています。 予想通り、Gelma バイオインクは温度掃引に対して同様のゾルゲル転移を示し、固定 UV 線量 (120 mJ/cm2) および印刷温度 (10 °C) で架橋が達成されました。 UV および固定処理条件を採用した後、光学画像を記録し、OAB プロセスを使用して印刷されたゲルマストラットのダイ膨潤率と劣化を測定しました（補足図 4c–e）。 Gelma バイオインクのすべての濃度で、約 1 のダイスウェリング比が観察されました。 ただし、3 wt% Gelma バイオインクでは不十分な架橋が観察されました (補足図 4e)。 結果に基づいて、さらなる評価のために、5 wt% の Gelma 濃度と次の印刷パラメーターを使用しました: UV 線量 = 120 mJ/cm2、印刷温度 = 10 °C。 補足図5に示すように、設定パラメータを使用したノズル内のUV光の分散は、押出ストラットのコア領域で架橋を引き起こす可能性がありますが、シェル領域の架橋は比較的少ないです。 これらのデータに基づいて、OAB システムの最適化されたパラメーターにより多層 3D 構造の製造が可能になると注意深く予測しています。

最近、形状モーフィングヒドロゲルまたは 4D バイオファブリケーションシステムが、生体模倣と複雑なマイクロアーキテクチャの形成を可能にするため、注目を集めています 29,30,31。 OABプロセスをさまざまな複雑な生物学的構造の4D作製に拡張するために、図4aの概略図に示すように、ノズルに2本の光ファイバー（光ファイバー-1と光ファイバー-2）を取り付けました。 この画像では、光ファイバー 1 がオンになると、印刷されたゲルマ構造の非対称光架橋が達成されます。 一般に、水膨潤が低い場合には高い弾性特性（≒高い架橋度）が誘導されるため 32、そのため、ハイドロゲルの非対称架橋の程度がハイドロゲルの湾曲の方向を決定すると考えられます。 図 4b は湾曲メカニズムを詳細に説明しており、非対称光架橋プロセスを使用して製造されたゲルマ ストラットの光学画像は、ストラットの非対称架橋を示すことができます。 図 4c、d は、光ファイバーの使用に応じた Gelma ストラットの湾曲能力を示しています。 非対称に光架橋されたゲルマストラットは、水にさらされると異なる膨潤速度を開始し、異なる架橋度によりストラットの断面方向に多様な膨潤挙動が起こり、スパイラル構造やS字型構造を形成しました。 実証された 4D 製造の概念実証に基づいて、OAB システムは血管形成や神経移植などのさまざまな生物学的用途に適用できると注意深く予測しています。

a 2 本の光ファイバーを使用した非対称光架橋の光学的および概略図。 b ゲルマストラットの形状モーフィング機構と作製したゲルマストラットの光学画像。 ゲルマ ストラットの非対称架橋に依存するゲルマ ストラットの湾曲能力 (c スパイラルおよび d 's' カーブの形成)。 スケールバー、100 μm (b)。 5 mm (c、d)。

前のセクションで述べたように、OAB プロセスの利点の 1 つは、ノズル材料の透明性やノズルの複雑さに関係なく、光架橋性バイオインクをノズル内で架橋できることです。 特定のノズル設計に関係なく、OAB プロセスの実現可能性を実証するために、3 つの異なるノズル (ガラス ノズル、不透明プラスチック ノズル、および圧搾鋼ノズル) が使用されました。 図5aに示すように、ガラスノズルを使用してGelmaバイオインクを押し出し、事前に設定したUVおよび印刷条件下でCBおよびOABプロセスで印刷されたGelmaストラットは、完全に同様の円筒形状を示しました（図5b）。 しかし、図5cに示す楕円形鋼製ノズルを使用してOABプロセスを採用した場合、CBプロセスで印刷されたストラット形状よりも鋼製断面ノズルの形状に似た形状のゲルマストラットが得られました。 (図5c、d)。

a CB および OAB (UV 線量 = 120 mJ/cm2) によって処理された印刷されたゲルマ ストラットの表面および断面の光学画像、および b 断面画像の真円度。 c、d 楕円形の断面形状を有する鋼製ノズル、CBおよびOABを介して加工された印刷されたゲルマストラット、およびアスペクト比（印刷されたストラットの長軸の長さ（L1）/短軸の長さ（L0））印刷されたストラットの断面光学画像を使用して決定されます。 e 異なる断面形状（N-1：丸、N-2：プラス、N-3：星）を持つ 3 つのプラスチック ノズルの光学画像と、各プラスチック ノズルと OAB プロセスを使用して製造された印刷された断面ゲルマ形状。 N-3-CB は、プラスチック ノズル形状 N-3 で処理され、OAB プロセスではなく CB プロセスで架橋されたゲルマの断面光学画像を示します。 f N-3 ノズルと OAB プロセスを使用したさまざまな Gelma 3D 構造を示す光学画像、および（g） N-3プラスチックノズルとOABプロセス。 すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 p 値は、スチューデントの t 検定によって計算されました (n = 3/グループ; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)。 スケールバー、1 mm (a、c ノズルおよびストラット)。 200 μm (a、c - ストラット断面、e - SEM、g - 蛍光および断面)。 500 μm (c、e - ノズル断面、f - 断面、g - ノズルの光学画像)。 5 mm (f - 側面図および上面図)。

さらに、OAB を使用して Gelma バイオインクを印刷するために、異なる断面形状 [円形 (N-1)、プラス型 (N-2)、星型 (N-3)] を持つ 3 つの不透明プラスチック ノズルが使用されました。図5eに示すようなプロセス。 OAB プロセスで印刷されたゲルマ ストラットの断面画像は、印刷ノズルの形状と同様の形状を示しますが、N-3 ノズルと CB プロセスで印刷されたゲルマ ストラット (N-3-CB) は形状を示しません。印刷ノズルと同様の形状（断面星形）。 さらに、補足図6は、さまざまなUV線量（0〜150 mJ / cm2）でN-2およびN-3ノズルを使用して印刷されたゲルマストラットの光学画像を示しています。 OABプロセスとN-3ノズルを使用して製造された3Dゲルマ形状を示すために、図5fに示す3つの異なる構造で形状を製造しました。

OAB プロセスの実現可能性をさまざまなメタクリル化ハイドロゲルに拡張するには、骨格由来のメタクリル化コラーゲン (Colma) (メタクリル化度: 79.3 ± 1.6%) および dECM メタクリレート (dECM-ma、メタクリル化度: 76.0 ± 2.4%) を使用します。筋肉組織が使用されました。 ブタ筋肉組織を使用した脱細胞化/メタクリル化プロセスの概略図が説明され（補足図7a）、筋肉組織、ColmaおよびdECM-maのDNA含有量とコラーゲン、エラスチン、GAG含有量が示されました（補足図7b–e）。 。 図 5g は、N-3 ノズルと OAB プロセスを使用して印刷されたストラットの表面および断面の光学および蛍光 (コラーゲン: 赤、フィブロネクチン: 緑) 画像を示しています。 Colma および dECM-ma ストラットでは、微細な溝のある表面パターンがはっきりと観察されました。

以下の印刷パラメータを採用します: UV 線量 = 120 mJ/cm2、温度 = 10 °C、印刷圧力 = 120 ± 10 kPa、ノズル移動速度 = 1 mm/秒、セルを含むゲルマ フィラメント (5 wt% ゲルマ、C2C12) CBおよびOAB-N-3（ノズル形状：N-3）プロセスを用いて、密度1×107細胞/mL）を作製した。 図6aに示すように、細胞を搭載したGelmaストラットの表面および断面の光学画像は、CBおよびOAB-N-3で処理されたストラットではそれぞれ円形および星形を示します。 細胞培養の 1 日および 3 日後のストラットの生（緑）/死滅（赤）画像および細胞生存率（CB = 92.5 ± 2.2% および OAB-N-3 = 91.9 ± 1.8%）から、次のようなプロセスが明らかになりました。各光架橋手順を含む、負荷された細胞にとって安全でした（図6b、c）。

a N-3 ノズルを使用して CB および OAB プロセスを使用して処理されたゲルマ ストラットの光学表面および断面画像。 b 培養 1 日目および 3 日目の生細胞 (緑)/死細胞 (赤)、および (c) 各ゲルマ ストラットの細胞生存率。 d Gelma ストラットの MTT アッセイを使用して測定された細胞増殖。 e 培養14日目のDAPI（青）/ファロイジン（赤）および（f）培養21日目のDAPI / MHC（緑）（白いボックスは拡大領域を示す）。 g 細胞培養21日目のC2C12を含むゲルマストラットのMHC配向因子、ポジティブインデックス、および融合インデックス。 h 細胞培養の14日および21日におけるCBおよびOAB-N-3構造におけるMHCおよびトロポニンTの相対的遺伝子発現。 すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 p 値は、スチューデントの t 検定によって計算されました (n = 5/グループ; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)。 スケールバー、500 μm (a - 表面、e、f - 上部パネル)。 200 μm (a - 断面、b); 100 μm (e、f - 下のパネル)。

さらに、ストラットの MTT アッセイを使用して細胞増殖を測定したところ、増殖速度はストラット間で有意な差がないことがわかりました。 ゲルマストラットの細胞形態を観察するために、14 日間の細胞培養後に DAPI (青)/ファロイジン (赤) 画像を取得しました。 記録された画像では、OAB-N-3 プロセスを使用して製造された溝付き表面パターンを持つゲルマ ストラットでは一軸に整列した F-アクチンが観察されましたが、CB プロセスで印刷されたストラットでは、同様に一軸に整列した F-アクチンが観察されました。達成されていません（図6e）。 さらに、細胞培養 21 日目の DAPI/MHC (緑色) 画像は、配向係数 (=[90 − φ]/90、φ = 配向分布の半値全幅) によって決定される、よく整列し加速された MHC を示しました。 ）、CBで処理したストラットよりもOAB-N-3で処理したGelmaストラットでより多くの正のインデックス/融合インデックス値が観察されました（図6f、g）。

印刷されたゲルマストラットの筋原性分化を観察するために、筋原性遺伝子発現（MHCおよびトロポニンT）を細胞培養の14日目および21日目に観察しました（図6h）。 筋原性遺伝子は、OAB-N-3 で処理された Gelma グループで上方制御されました。 これは、細胞の整列を誘導するために特別に設計されたノズル内部の地形的手がかり (溝の形状) によるものでした。 これらの結果は、一軸の地形パターンを持つさまざまな足場が筋芽細胞の整列、さらには筋管形成さえも調整できることを実証したいくつかの研究の結果とよく一致しています 33,34,35。 ここでは、不死化 C2C12 細胞を使用して、インビトロの細胞活性を評価しました。 ただし、初代自家細胞または同種異系細胞を使用した場合、in vitro の結果は異なる場合があります。

CB、OAB-N-1（ノズル形状：N-1）、OAB-N-3（ノズル形状：N-3）プロセスで作製した hASC 搭載ゲルマストラットを VML 組織再生に適用し、マウスモデルの元の TA 筋の 40% を切除することによって行われます 36。 この分析では、hASC の筋原性系統を含むいくつかの細胞系統への分化は、さまざまな化学的および物理的刺激によって誘導される可能性があるため、欠陥のある VML の再生をサポートするために hASC を使用しました 37,38。 図7aに示すように、作製されたhASCを含むGelmaコンストラクト（細胞密度 = 1×107細胞/mL、サイズ = 2×4×1.6 mm3）（CB、OAB-N-1、およびOAB-N-3）欠陥のある筋肉領域に適用されました。 予想通り、hASCは3つの構造すべてで生きており、OAB-N-3グループに含まれる細胞は、CBおよびOAB-N-1のものと比較して印刷方向によく整列していました（図7a〜c）。

a：それぞれ N-1 ノズルと N-3 ノズル。 b 細胞培養1日および3日における筋肉構築物の細胞生存率（グループあたり n = 5、各サンプルに4つのランダムフィールド）および（c）細胞培養14日におけるF-アクチンを使用した配向因子（n = 5）グループごとに、各サンプルに 4 つのランダム フィールド）。 d TA筋欠損に移植された構築物の全体的な外観。 定量化された（e）握力、（f）落下までの潜時テスト、および（g）4週間の移植後の筋肉重量（動物あたりn = 5、サンプルあたり3回の繰り返し測定）。 h 移植部位の H&E (紫: 核、ピンク: 細胞質)、MT (赤: 筋線維、青: コラーゲン)、および DAPI/MHC (緑)、(i) 線維化領域 (%) (n = 5/グループ、各サンプルに4つのランダムフィールド）、（j）中心に有核のある筋線維（％）（グループあたりn = 5、各サンプルに4つのランダムフィールド）、（k）末梢に有核のある筋線維面積（％）（グループあたりn = 5、4各サンプルのランダムフィールド）、（l）筋線維の直径（μm）（グループあたりn = 25、各サンプルに4つのランダムフィールド）、および（m）MHC陽性面積（％）（グループあたりn = 5、4つのランダムフィールド）各サンプルのランダム フィールド）、偽、欠陥のみ、CB、OAB-N-1、および OAB-N-3 サンプルの場合。 すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 p 値は、スチューデントの t 検定 (b、c)、および Tukey の事後検定 (e-m) を使用した一元配置分散分析によって計算されました (NS 統計的有意性なし、*p < 0.05; **p < 0.01; *** p < 0.001)。 スケールバー、2 mm (a-光学、d)。 500 μm (a-生/死、h-H&E)。 100 μm (a-DAPI/ファロイジン); 50 μm (h-H&E 拡大、MT、DAPI/MHC)。

VML 筋再生の効率を評価するために、5 つのグループ: (1) 偽 (欠損なし)、(2) 欠損のみ、(3) CB、(4) OAB-N-1、および (5) OAB-N-3群をマウスモデルに移植した（図７ｄ）。 握力と転倒までの潜伏期間の評価は、筋肉の再生効果の信頼できる評価となります14,40,41,42。 したがって、構造物の移植後4週間のマウスにおける握力テストと転倒潜時テストの結果を図7e〜gに示します。 OAB-N-3 グループは他のグループよりも有意に高い握力を示し、シャムと同様の握力を示しました（図 7e）。 ただし、転倒潜時時間は、他のグループと比較して比較的長い潜伏時間を示しましたが、偽グループよりは大幅に低かった（図7f）。 我々は、これらの所見は、VML欠損後の筋線維の除神経によるものであり、その結果、機能障害が生じたものであると考えています42、43、44。 この効果を評価するために、採取した筋肉切片をアセチルコリン受容体（AchR）で染色しました（補足図8a）。 他のグループと比較して、OAB-N-3を投与されたマウスではAchRの有意に高い発現が観察されました（補足図8b）。 さらに、OAB-N-3 グループの筋肉重量は偽グループの筋肉重量と非常に類似していました (図 7g)。 図7hは、H＆E、MT染色、およびDAPI / MHCの縦方向の組織学的結果を示し、補足図9は断面H＆E染色を示しています。 線維化領域、中心有核筋線維、末梢有核筋線維領域、筋線維の直径、およびMHC陽性領域が測定され、結果が図7i〜mに示されています。 結果に示されているように、CB および OAB-N-1 グループの対応する値と比較して、OAB-N-3 グループではより効率的な筋肉再生と低度の線維化 (MT 染色の青い領域) が検出されました。これは、OAB-N-3 プロセスで使用されるノズルの溝によって引き起こされる地形的な手がかりです。 さらに、OAB-N-3 で処理したマウスから採取した筋肉切片の中心有核筋線維は、欠損、CB、および OAB-N-142、45、46 の筋線維と比較してかなり低かった。 これらの結果に基づいて、我々は、OAB-N-3 バイオコンストラクトが、地形的な手がかりなしに CB および OAB-N-1 グループよりも効果的な筋肉再生を誘導できると注意深く予測します。

さらに興味深いことに、MHC/MRPL11およびMHC/HLA-Aの二重免疫蛍光によって確認されたように、移植された構築物で形成された筋線維は、それぞれCB、OAB-N-1、およびOAB-N-3のプリントされたhASCに由来していました。移植後 4 週間目 (図 8a)。 特に、OAB-N-3グループは他のグループ（CBおよびOAB-N-1）よりも有意に高いMRPL11およびHLA-A陽性筋線維を有することが観察できます（図8b、c）。 組織学的結果に基づいて、OAB-N-3 プロセスを使用して処理された細胞を含む Gelma コンストラクトを使用した筋肉の再生は、CB および OAB-N-1 プロセスを使用して処理された Gelma コンストラクトを使用した場合と比較して加速できると結論付けることができます。 しかし、提案された構築物 (OAB-N-3) に関するこれらの良好な筋再生結果にもかかわらず、マウス VML モデルの欠損サイズが小さいため、臨床的関連性が欠けていることは指摘する価値があります。

a DAPI (青)/MHC (赤)/MRPL 11 (緑) および DAPI (青)/MHC (赤)/HLA-A (緑) の二重免疫蛍光画像。 定量化された (b) MRPL11 および (c) HLA-A 陽性筋線維 (%) (グループあたり n = 5、各サンプルの 4 つのランダム フィールド)。 すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 p 値は、Tukey の事後検定を使用した一元配置分散分析によって計算されました (NS = 統計的有意性なし、*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001)。 スケールバー、200 μm (a-DAPI/MHC/MRPL11)。 50 μm (a-DAPI/MRPL11、DAPI/HLA-A); 100 μm (a-DAPI/MHC/HLA-A)。

この研究では、組織工学用途向けに微細パターン表面を備えた細胞含有フィラメントを製造するための、光ファイバー支援光架橋法を補足した新しいバイオプリンティングプロセスを開発しました。 地形的な手がかりを備えた生体機能細胞を含むストラットを取得するために、UV 線量や印刷温度などの適切な印刷パラメータが慎重に選択されました。 バイオプリンティング プロセスの実現可能性を実証するために、C2C12 筋芽細胞と hASC を使用して、マウス モデルにおける in vitro 筋原性活動と in vivo 体積筋欠損をそれぞれ観察しました。 OAB-N-3 で処理された細胞を含む Gelma コンストラクトの生体模倣表現型の結果として、従来の印刷プロセスで印刷されたバイオコンストラクトと比較して、in vivo VML 修復の改善が観察されました。 これらの結果に基づいて、光ファイバー支援架橋と組み合わせた新しく設計されたバイオプリンティングプロセスは、さまざまな組織再生に応用するための生体機能細胞を含む構築物を作製するための有望なアプローチとして機能すると我々は信じている。

光ファイバー支援バイオプリンティング システムは、3D プリンター (DTR3-2210 T-SG、DASA Robot、韓国)、UV スポット ヘッドを備えた紫外線 (UV) 発生装置 (LGA-20562、Liim) の 3 つの主要部分で構成されていました。 Tech、韓国）、および図1a〜cに示すように、光ファイバーと組み合わせたノズル。 UV 放射に対する減衰が低い (40 db/km) 石英光ファイバー (直径 = 200 μm、長さ = 5.5 cm、開口数 = 0.22、Edmund Optics、ニュージャージー州、米国) を Edmund Optics (米国ニュージャージー州バリントン) から購入しました。 。 プラスチック ノズルは、デジタル光処理 3D プリンター (X-CUBE3、Foshan Stek Technology、中国) と光硬化性アクリル樹脂 (3DV-301、WOW 3D、韓国) を使用して製造されました。 印刷後、ノズルをエタノールで洗浄し、室温で乾燥させた。 続いて、光ファイバーをプラスチックのノズルに挿入しました。

ゼラチンのメタクリル化は以前に報告されたように実行されました47。 簡単に説明すると、ブタの皮膚から得たゼラチン (10 wt%; 300 g Bloom; Sigma-Aldrich) をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に溶解しました。 無水メタクリル酸（Sigma-Aldrich、米国）を50℃で滴下し、溶液を500rpmで3時間撹拌した。 ゲルマは、分子量カットオフ 12 kDa の透析膜 (Thermo-Fisher Scientific、米国) を使用して蒸留水中で 40 °C で 7 日間透析し、残留メタクリル酸無水物を除去しました。 最後に、ゲルマは凍結乾燥され、極冷凍庫に保管されました。

Gelma 溶液 (5 wt%) を、フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム (0.05 wt%; Sigma-Aldrich, USA) を含む PBS に 37 °C で溶解しました。 Gelma ハイドロゲルを滅菌するために、0.22 μm シリンジ フィルター (Thermo-Fisher Scientific、米国) を使用しました。 2 つの異なる Gelma バイオインクは、C2C12 マウス筋芽細胞 (CRL-1772; ATCC、米国バージニア州マナッサス) および hASC (PT-5006; Lonza、バーゼル、スイス) と 1 × 107 細胞/mL の密度で混合することによって得られました。

アクリル平行板形状 (直径 = 40 mm、ギャップ = 200 μm) を備えた Bohlin Gemini HR Nano 回転レオメーター (Malvern Instruments、英国) を使用して、Gelma バイオインクのレオロジー特性を評価しました。 Gelma バイオインクの時間掃引テスト (ひずみ = 1%、温度 = 10 °C、周波数 = 1 Hz) がさまざまな UV 条件下で実施されました。 Gelma 溶液の温度掃引試験 (4 ～ 45 °C) は、1 Hz の固定周波数および 1% のひずみのもと、ランピング速度 (5 °C/分) で実施されました。

3 軸印刷システム (DTR3-2210 T-SG、DASA Robot、韓国) および分注システム (AD-3000C、Ugin-tech、韓国) と組み合わせた光ファイバー ノズルを使用して、細胞を搭載した構造体を作製しました。 。 プロセスパラメータは次のとおりです: ノズル移動速度 = 2 mm/秒、バイオインク流量 = 0.045 mL/分、バレル温度 = 10 °C、およびウォータージャケット温度 = 4 °C。 押出プロセス中、バイオインクは架橋のために 120 mJ/cm2 の UV 線量 [(線量 = Iv × t; Iv = UV 強度 (20 mW/cm2)、t = UV 曝露時間 (6 秒)] に同時に曝露されました。 ＵＶ強度は、ＵＶ光度計（ＬＳ１２５；林上、中国）を使用して測定した。

形態学的特徴付けは、デジタルカメラと走査型電子顕微鏡 (SNE-3000M; SEC, Inc., 韓国) を備えた光学顕微鏡 (BX FM-32; オリンパス、東京、日本) を使用して実行されました。 ImageJ ソフトウェア (米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所) を使用して、断面グレー値、真円度 (=4π × A/P2、A = 面積、P = 周長)、および決定されたアスペクト比間の差異を検出しました。最長/最短の長さで判断します。 生分解性速度は、サンプルを 37 °C の PBS に 7 日間浸漬することによって評価されました。 ストラット直径の変化の違いが、劣化速度を測定するために考慮されました。

構造の引張試験および重ねせん断試験を含む機械的解析は、万能引張試験機 (Toptech 2000、Chemilab、韓国) を使用して実行されました。 引張特性を測定するために、サンプル (10 × 3 × 1.6 mm3) を 30 kgf のロードセルを使用して 0.5 mm/s の速度で試験しました。 印刷された構造体 (10 mm × 25 × 1.6 mm3) 間の接着特性を計算するために、ASTM F2255-0548 に基づいて 0.5 mm/s の引張速度でせん断試験を行いました。

in vitro 評価では、細胞密度 1 × 107 細胞/mL、寸法 6 × 30 × 1.6 mm3 の細胞を含む構築物 (C2C12 筋芽細胞または hASC) をバイオプリントしました。 C2C12 を含む構築物を、1% ペニシリン - ストレプトマイシン (Pen-Strep、Thermo-Fisher Scientific、米国) および 10% ウシ胎児血清を含む高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を含む 6 ウェル組織培養プレートで培養しました。 FBS、Gemini Bio-Products、米国）。 さらに、筋形成を誘導するために、2％ウマ血清を添加したDMEM高グルコース（Sigma-Aldrich、セントルイス、米国）を使用しました。 hASCを含む構築物を、1% Pen-Strepおよび10% FBSを含む低グルコースDMEMを含む6ウェル組織培養プレートで培養した。 さらに、5% 馬血清、0.1 μM デキサメタゾン、および 50 μM ヒドロコルチゾンを含む DMEM 低グルコース サプリメントを使用しました。 すべてのサンプルの培地を 3 日ごとに交換しました。

細胞を含む構築物内の細胞生存率は、生死アッセイキット (Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド) を製造業者の指示に従って使用して調査しました。 細胞を含む構築物を1日間の培養後に収集し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄し、試薬溶液(DPBS中0.15mM/mLカルセインAMおよび2mMエチジウムホモダイマー-1)中で室温で2時間インキュベートした。生死アッセイには 40 分。 DPBS で穏やかに洗浄した後、共焦点顕微鏡 (LSM 700、Carl Zeiss、ドイツ) を使用して、染色サンプルの 3 つの画像を取得しました。 これらの画像を使用して、ImageJ ソフトウェアを使用して生細胞 (緑) と死細胞 (赤) の数を数えることにより、細胞生存率の平均値 (%) を全細胞に対する生細胞の割合として定量化しました。

構築物内の細胞代謝活性は、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5 ジフェニル テトラゾリウム ブロミド (MTT) アッセイ キット (Boehringer Mannheim、マンハイム、ドイツ) を使用して測定しました。 1、3、および 7 日間の培養後、生細胞のミトコンドリア デヒドロゲナーゼの活性を、0.5 mg/mL の MTT 溶液に 37 °C で 4 時間曝露した後、570 nm の吸光度で測定しました。 無細胞構築物から得られた吸光度値を、細胞を含む構築物から得られた吸光度値から差し引いた。

C2C12 筋芽細胞および hASC を含むバイオプリントされたコンストラクトを 3.7% パラホルムアルデヒド (Sigma-Aldrich) で 30 分間固定し、無血清タンパク質ブロッキング剤 (Agilent) を使用して 1 時間ブロックし、0.1% Triton X-100 ( Sigma-Aldrich) を 3 分間加熱します。 バイオプリントされたコンストラクト内の細胞骨格は、Alexa Fluor 594 結合ファロイジン (赤; DPBS で 1:100、Invitrogen) を使用した免疫蛍光によって視覚化され、核はジアミジノ-2-フェニリノドール (DAPI) (青; 1:100) で染色されました。 DPBS; Invitrogen)。 配向係数 [=(90° − φ)/90°、φ = 半値全幅 (FWHM)] は、ImageJ ソフトウェアを使用して分析されました。

ミオシン重鎖 (MHC) 免疫蛍光の場合、バイオプリントされたコンストラクトを抗 MF20 一次抗体 (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank、アイオワ州、アイオワ州、米国) で処理し、4 °C で一晩インキュベートしました。 次に、サンプルを DPBS で洗浄し、Alexa Fluor 488 結合二次抗体 (緑色、DPBS 中 1:50、Invitrogen) とともに 1 時間インキュベートしました。 最後に、核を DAPI で染色しました。 MHC/DAPI 免疫蛍光画像は共焦点顕微鏡を使用して視覚化およびキャプチャされ、筋線維成熟度 (MHC 陽性指数および融合指数) は ImageJ ソフトウェアを使用して定量化されました。

リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) 分析では、培養 14 日および 21 日後にバイオプリントされた構築物を収集し、MHC およびトロポニン T 筋原性遺伝子マーカーを使用しました。 簡単に説明すると、細胞を含む構築物を TRIzol 試薬 (Sigma-Aldrich) で処理して RNA を単離しました。 RNA の濃度と純度は、分光光度計 (FLX800T、BioTeK、米国) を使用して測定しました。 RNA サンプルは、cDNA 合成前に RNase フリー DNase で処理されました。 cDNA サンプルは、Power SYBRVR Green qPCR Master Mix (Qiagen) を使用して合成しました。 StepOnePlus リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems、米国) を使用して、メーカーのプロトコールに従って RT-PCR 分析を実施しました。 ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) を正規化に使用しました。 標的遺伝子の具体的なプライマー配列を表 1 に示します。

TA 筋欠損は、C57BL/6 マウス (雄、10 週齢、DooYeol Biotech, Inc.、ソウル、韓国) に作成され、すべての動物手順は、動物実験および研究諮問委員会によって承認されたプロトコールに従って実行されました。成均館大学医学部実験動物研究センターであり、施設内倫理委員会の規定（SKKUIACUC2021-08-11-2）を遵守しました。 簡単に説明すると、マウスをランダムに 5 つのグループに分けました (合計 25 匹のマウス、各グループ n = 5)。 移植前に、まずマウスを３％ｖ／ｖイソフルランを使用して麻酔し、左右の脚の下の皮膚を切開して筋膜から筋肉を分離した。 この後、長趾伸筋と長母趾伸筋を除去して体積筋損失（VML）損傷を誘発し、TA筋の約40％を切除して重量を量りました（補足表1）。 VML 修復のために、hASC を含むバイオプリントされた構築物 (2 × 4 × 1.6 mm3) が TA 筋欠損領域に移植され、縫合された筋膜と皮膚で覆われました。 移植後、マウスには痛みを制御するために 0.5 mg/kg のブプレノルフィンが皮下注射され、手術後は通常通り餌と水が与えられました。 移植の 4 週間後、マウスは CO2 吸入と二次頚椎脱臼によって安楽死させられました。 移植前に、hASC を含む構築物を増殖培地で 1 日間培養して細胞を安定化させました 31,49。

さまざまな治療を受けたマウスの骨格筋機能は、握力と転倒するまでの時間を測定することによって評価されました。 移植後 4 週間のマウスの最大握力は、記載されている手順 50 に従って、マウスをグリッド線に平行に引っ張り、握力を測定することによって測定されました (握力メーター、BIO-G53、BIOSEB、フロリダ州、米国))。 さらに、マウスを棒の上に置いた後の経過時間を測定することによって、落下するまでの時間を評価した。 最大潜伏期間は 300 秒に設定されました。 各実験はマウス１匹につき３回繰り返された。 繰り返しの間には 5 分間の間隔を設けました (動物あたり n = 5、サンプルあたり 3 回の繰り返し測定)。

組織学的染色のために、採取した TA 筋肉サンプルを 10% 中性緩衝ホルマリンで 24 時間固定しました。 次に、サンプルを脱水し、パラフィン包埋し、厚さ 5 ミクロンのスライスに切片化しました。 筋肉切片をヘマトキシリン アンド エオシン (H&E) およびマッソン トリクローム (MT) で染色しました。 H&E 染色画像と MT 染色画像を ImageJ ソフトウェアで分析し、中心に有核筋線維、末梢に有核筋線維領域、線維化領域をそれぞれ定量しました (サンプルあたり n = 5、各サンプルに 4 つのランダムフィールド)。 中心に有核の筋線維と末梢に有核の筋線維は、imageJ のマルチポイント ツールを使用して手動でカウントされます。 中心有核筋線維は、中心有核筋線維の数を筋線維の総数で割ることによって得られた。 さらに、末梢有核筋線維面積を、末梢有核筋線維の面積を総筋線維面積の面積で割ることによって計算した。

免疫蛍光染色の場合、切片サンプルを抗 MF20 一次抗体 (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank、アイオワ州アイオワ市)、抗 MRPL11 (ウサギ ポリクローナル抗ミトコンドリア リボソーム タンパク質 L11、種反応性: ヒト、1) で処理しました。 :100 希釈、Abcam、ケンブリッジ、英国)、抗 HLA-A (種の反応性: ヒト、1:100 希釈、Abcam、ケンブリッジ、英国)、抗 CHRNB2 (神経アセチルコリン受容体サブユニット ベータ 2、1:100 希釈) 、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用し、４℃で一晩インキュベートした。 次にサンプルを DPBS で洗浄し、Alexa Fluor 488 結合二次抗体 (緑色、DPBS 中で 1:50、Invitrogen) または Alexa 594 結合二次抗体 (赤色、DPBS 中で 1:50、Invitrogen) および Alexa 488-結合抗ウサギ IgG (1:200 希釈、Invitrogen) を 1 時間処理しました。 最後に、核を DAPI で染色しました。 MHC/DAPI 免疫蛍光画像は、共焦点顕微鏡を使用して取得されました。 フィールドあたりの筋線維の面積 (%) (サンプルあたり n = 5、各サンプルの 4 つのランダム フィールド)、筋線維の直径 (サンプルあたり n = 25、各サンプルの 4 つのランダム フィールド)、および MHC 陽性面積 (%) ) (サンプルあたり n = 5、各サンプルの 4 つのランダム フィールド) を、MHC/DAPI の免疫蛍光画像 (倍率 400 倍) を用いて盲検法で測定しました。 MRPL11 および HLA-A 陽性筋線維の面積 (%) を、MHC/MRPL11 および MHC/HLA-A の二重免疫蛍光画像 (倍率 400 倍) を用いて盲検法で測定しました (サンプルあたり n = 5、それぞれに 4 つのランダムフィールド)サンプル）。 すべてのサンプル画像は、ImageJ ソフトウェアを使用して定量化されました。 すべての値は平均値 ± 標準偏差として表示されます。

SPSS ソフトウェア (SPSS, Inc., USA) を使用して統計分析を実行しました。 2 つのグループの比較は t 検定によって評価され、3 つ以上のグループは Tukey の HSD 事後検定を使用して一元配置または二元配置分散分析 (ANOVA) を評価することによって比較されました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 の値は統計的に有意であるとみなされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、科学・情報通信省によるバイオインスピレーションイノベーション技術開発プロジェクト（NRF-2018M3C1B7021997およびNRF-2021R1A5A8029876 to DR）および基礎科学研究プログラム（NRF-2021R1I1A1A01061021）による韓国国立研究財団（NRF）助成金によって支援されました。 。 この研究は、産業通商資源部（MOTIE、韓国）の産業技術革新プログラム（20009652：マイクロメートル未満の生体吸収性ハイドロキシアパタイトの商品化および材料に関する技術）による助成金によっても支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました：JaeYoon Lee 氏、H Hyunjin Lee 氏。

韓国、水原、成均館大学医学部精密医学科

イ・ジェユン、イ・ヒョンジン、キム・グンヒョン

高麗大学校バイオテクノロジー・バイオインフォマティクス学部、世宗市、大韓民国

イ・ヒョンジン

韓国水原市成均館大学医学部分子細胞生物学教室

ジン・ウンジュ＆リュ・ドンリオル

光州科学技術大学生物医科学工学科、韓国光州市

リュ・ドンリョル

韓国、水原、成均館大学量子生物物理研究所生物物理学科

キム・グンヒョン

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JYLee: 概念化、データ分析、方法論、調査、視覚化。 H.Lee: データ分析、方法論、調査、視覚化、執筆—原案。 EJJ: データ分析、調査。 DR: 監修、データ分析、執筆—原案、資金調達。 GHK: 監修、プロジェクト管理、コンセプト化、データ分析、原案執筆、レビューと編集、資金調達。

リュ・ドンリョルまたはキム・グンヒョンへの通信。

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転載と許可

リー、ジェイ、リー、H、ジン、EJ。 他。 筋肉組織修復のための新しい光架橋法を使用した 3D バイオプリンティング。 npj Regen Med 8、18 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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受信日: 2022 年 7 月 2 日

受理日: 2023 年 3 月 17 日

発行日: 2023 年 3 月 31 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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