ポストの予測と解明 | 合肥珊瑚礁株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1211 (2023) この記事を引用

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12 オルトメトリック

メトリクスの詳細

3D バイオプリンティングを他の 3D 細胞培養技術と区別する主な特徴は、作成された構造を正確に制御できることです。この特性により、多孔性、透過性、剛性などの制御された構造的および機械的特性を備えた生体模倣構造の高解像度の製造が可能になります。ただし、プリンティング後の細胞のダイナミクスを分析し、3D 製造環境内でその機能を最適化することは、試行錯誤といくつかの実験の繰り返しを通じてのみ可能です。この問題は、3D バイオプリント構造内でのプリント後の細胞の挙動をシミュレートするためのセルオートマトンモデルの開発を初めて動機付けました。モデルを改善するために、MDA-MB-231 細胞を含むヒドロゲルを使用して 3D 構築物をバイオプリントし、11 日間で生存率や増殖などの細胞機能を評価しました。結果は、私たちのモデルが 3D バイオプリント構造をうまくシミュレートし、in vitro 観察をキャプチャしたことを示しました。我々は、コストと時間のかかるいくつかの in vitro 測定を繰り返すことなく、インシリコモデルが、バイオインク中のさまざまな初期細胞数や、ゼラチンとアルギン酸塩を含むさまざまなバイオインク配合物に対するプリンティング後の生物学的機能を予測および解明できることを実証しました。私たちは、このような計算フレームワークが 3D バイオプリンティングの将来の応用に大きな影響を与えると信じています。私たちは、この研究が研究者たちに、インシリコモデルをどのように活用してインビトロ 3D バイオプリンティング研究を前進させることができるかをさらに理解してもらうことを願っています。

急成長している 3D バイオファブリケーション法の 1 つは 3 次元 (3D) バイオプリンティングであり、複雑な組織模倣構造を作製するために再生医療や組織工学に広く応用されています 1。この技術の応用は、薬物放出の制御、がん治療のための薬物スクリーニング、起こり得る副作用の研究、腫瘍細胞の転移と浸潤の分析にさらに重点を置いた個別化治療において大きな可能性を秘めています2。 3D バイオプリンティング技術は、細胞、生体材料、制御された運動システムを組み合わせて複雑な 3D 構造を開発し、機械的特性、多孔性、透過性、剛性などの構造の特徴を正確に制御します3、4、5。この技術は、細胞の生息環境の重要な側面を組み込むことで、従来の 3D 手法の複数の制限を克服できます。これらの側面には、腫瘍の天然細胞外基質 (ECM) に似た不均一な 3D 微小環境、細胞と隣接細胞および局所 ECM との複雑な相互作用、栄養素と酸素の複雑な拡散プロセスが含まれます 6、7、8。したがって、この方法を使用すると、細胞増殖メカニズムに関する洞察をより適切に表現し、in vivo の腫瘍動態と治療に対するがん細胞の反応をより正確に予測できます7。

3D バイオプリンティング手法は急速に進歩していますが、対処する必要のある課題がいくつかあります。現在、バイオプリンティング技術は所望の出力を達成するために主に試行錯誤ベースに基づいており、実験技術の必要性が増加しています。この試行錯誤の基礎には、バイオインクの特性とその印刷適性、構造の機械的強度、印刷中および印刷後の細胞生存率の最適化が含まれます。したがって、バイオプリンティング関連の実験を最適化するには非常にコストがかかります9。これらの課題により、このプロセスにおける実験計画とデータ収集がより複雑になります。

インシリコ法を使用すると、インビトロ実験を補完し、この 3D 法の制限の一部に対処するのに役立ちます 10、11、12。一般的なインシルコアプローチには、機械学習 (ML) 手法と機構モデリングが含まれます。 ML モデルは、ディープニューラルネットワーク、ランダムフォレスト、サポートベクターマシン (SVM)、およびツリー分類器としてさらに分類できます。 ML は、プロセスの最適化、構造精度分析、欠陥診断、バイオインクの特性予測など、3D プリンティングプロセスのさまざまな段階で適用されることがよく知られています 13。たとえば、Xu ら 14 は、ML アプローチを使用して細胞生存率を感度よく予測し、光造形ベースの 3D バイオプリンティングにおける細胞生存率に対する UV 強度や UV 曝露時間を含むさまざまなプロセスパラメーターの重要性を評価する予測モデルの作成に成功しました。。複数の研究では、バイオインクの印刷適性を最適化するためのさまざまな ML ベースの技術の開発も試みられています。例えば、Lee j et al.15 は、重回帰分析を使用して、印刷適性とインクの機械的特徴との関係を実証しました。ただし、生物医学科学における ML モデルの適用は大きく進歩しているにもかかわらず、この方法はデータ収集のプロセスや研究の目的によってはいくつかの制限に直面しています。

正確な予測を行うには、ML モデルには大量のデータ、適切なアルゴリズムの選択、対象となる入力と出力の決定が必要です16。高価な細胞や材料、時間のかかるプロセスを伴うバイオプリンティング研究から大量のデータを取得することは非現実的かもしれません。 ML アプリケーションのもう 1 つの一般的な課題は、解釈が難しいことです。これは、バイオプリント構造における細胞挙動の機構的な解釈を求める研究者からの信頼の欠如につながる可能性があります17。対照的に、メカニズムのモデリングは、基礎となるメカニズムの仮説を介して現象を説明することに関係します。機構モデルには、確率モデルおよびエージェントベースのモデル、離散モデル、常微分方程式 (ODE)、および偏微分方程式 (PDE) が含まれます。このような機構モデルは、バイオプリント構造における細胞の挙動の機構的側面への洞察を提供する可能性があります。したがって、この研究では推奨される数学的手法です。

3D バイオプリンティングプロセスの一環として、機構のモデリングとシミュレーションに関する研究が増加しています。たとえば、ノズル内のバイオインクと細胞にかかるせん断応力を予測する数学的研究が複数あります 18,19。バイオインク材料の特性に基づいて最終的な印刷構造の機械的特性を予測します20。バイオインクの堆積と作成された 3D 構造の最終的な形状をシミュレートします9。これらの数学的手法は、細胞生存率や構造安定性など、バイオプリンティングのさまざまな側面に対するさまざまなパラメーターの影響を調査するために、バイオプリンティング中およびバイオプリンティング後のバイオプリンティングプロセスをシミュレートすることを試みてきました。

しかし、3D バイオプリント構造に埋め込まれた細胞のプリント後の挙動に関する包括的な計算機研究はまだ報告されていません。このような数学的研究は、研究者にプリンティング後の細胞機能についてのより多くの洞察を提供し、複雑な細胞活動を予測し、実験的評価を最小限に抑えることでお金と時間を節約するために細胞の微小環境を最適化することを可能にします。これは、インビトロおよびインシリコの3Dバイオプリント乳がんモデルの統合を開発して、3Dバイオプリント構造に埋め込まれた乳がん細胞集団のプリント後の挙動を研究することを目的とした最初の研究です（図1）。インビトロ研究では、がん関連研究で最も頻繁に使用される最も悪性度の高い乳がん細胞株の 1 つである MDA-MB-231 細胞株を使用しました。バイオインクを開発するには、ゼラチンとアルギン酸塩の混合物が、ネイティブ ECM と同様の特性とバイオプリンティング用途に適切な生理学的および生物学的特性により、3D バイオプリンティングで最も一般的なバイオインク材料として選択されます 21。インシリコ研究では、パラメータのほとんどが実験データから抽出されたセルオートマトンモデリングを選択しました。モデルの信頼性を向上させるために、包括的な in vitro アッセイも行われました。

この研究に含まれる主な手順の概略図。ステップ1：ゼラチン、アルギン酸塩、MDA-MB-231細胞株からなるバイオインクを調製する。ステップ 2: 細胞を含む 3D 構造を印刷および架橋する。ステップ３：プリント後のインビトロアッセイを実行する。ステップ 4: インシリコモデルの開発と調整。 BioRender.com で作成されました。

この研究で提案されたエージェントベースのモデルは、細胞の増殖、移動、環境との細胞相互作用（ECM、隣接細胞、リソース消費など）、足場内での細胞凝集などの複雑な細胞システムを実証するのに有益です。この研究では、数学的モデルとインシリコシミュレーションを使用してインビトロダイナミクスを捕捉できることを実証します。このようにインビトロ研究とインシリコ研究を組み合わせることで、最適化と実験設定の精度を加速および向上させることを目的として、3D バイオプリント構造内の細胞活動に対する研究者の理解を向上させることができます。提案されたインシリコモデルは非常に有望であり、さまざまな生物医学用途におけるバイオプリンティング技術を使用した 3D 細胞培養に適用できるようにさらに開発することができます。

腫瘍様ヒドロゲルネットワークモデルが正常に印刷されました (図 2a)。ハイドロゲル内に埋め込まれた MDA-MB-231 細胞の増殖を測定するために、MTT アッセイを使用して 0、4、7、10、および 11 日目の細胞代謝活性をモニタリングしました。図 2b に示すように、0 日目と比較して、 3D 細胞/ヒドロゲル構築物中の MDA-MB-231 細胞は、4、7、10、11 日目にそれぞれ 1.86 倍、2.7 倍、2.78 倍、2.8 倍の増殖を示しました。実際、細胞は最初の 7 日間で急速な増殖を示し、7 日目から 11 日目までほぼプラトー状態にある細胞増殖をほぼ維持しました。興味深いことに、結果は、3D 微小環境にカプセル化された MDA-MB-231 の倍加時間が 3 倍高いことを示しました。これは、3D マトリックス内での細胞活性の低下に起因すると考えられます 22。 7 日目から 11 日目まで、増殖細胞の数はほぼ一定のままであり、望ましくない条件により細胞が死滅したのか、それとも非増殖期 (静止期) に入ったのかという疑問が残りました。この質問に答えるために、11 日間、生死アッセイと Ki-67 免疫染色をさらに使用して、3D 足場にカプセル化された細胞の挙動の成長をより深く理解しました。

(A): 3D バイオプリンティング技術を使用して作製された細胞/ヒドロゲル構造。 (B): 0 日目から 11 日目までの印刷後のヒドロゲルネットワークに埋め込まれた MDA-MB-231 の増殖。エラーバーは ± SD、n ≥ 3 を表します。

11 日間にわたる MDA-MB-231 の生存率は、生死染色を使用して視覚化され、これは MTT アッセイの結果と一致しました。図 2 に示すように、ほとんどの細胞はプリンティング後も生存しており、細胞の生存率は 0 日目で 76 ± 2% であり、細胞生存率に対するバイオプリンティングプロセスの軽度の損傷が明らかに示されました。生存率は最初の 1 週間で増加し、4 日目と 7 日目にはそれぞれ 98 ± 1% と 99 ± 1% に達しました。したがって、この構造は、酸素とグルコースがヒドロゲル足場を通って拡散および分布するのに十分な多孔性を有しており、細胞に適切な生存環境を提供することができます。 7 日目から 11 日目まで、一部の細胞は死滅しましたが、大部分の細胞は生存し、11 日目には生存率が 96 ± 2% に達しました。生死アッセイと MTT アッセイの結果を比較すると、次のように結論付けることができます。足場の最大能力に達してから 7 日後にかなりの部分の細胞が休止期に入り、一部の細胞は長期の静止期中、またはリソースの不足により死滅し始めました。この実験における細胞死はほとんど無視できるほどであり、これはバイオプリンティング用途におけるゼラチン/アルギン酸塩足場の長期にわたる有望な可能性を示しています。

MDA-MB-231 の増殖能力を視覚化するために、細胞を固定し、抗 Ki-67 抗体を使用して、共焦点顕微鏡を使用して増殖細胞を画像化しました (図 3、4)。 Ki-67 は、細胞周期のすべての活動期に存在するが、定常期の細胞には存在しない、一般的に使用されるマーカーです 23。結果は、0日目と4日目には、それぞれほぼ98±1%と95±2%の細胞がki-67陽性であったが、この数は7日目には86±2%に減少し、その後劇的な低下を示した。この結果は、前のデータ (図 3) と一致しており、7 日以内に細胞が生き残るだけでなく、その増殖能力も維持していることを示しています。 7 日目から 11 日目まで、高い割合の細胞が生きていることが示されましたが、細胞が増殖するための十分なスペースが不足しているため、細胞は静止しており、それ以上増殖することができませんでした。さらに、7 日目と 11 日目には、特に細孔付近で細胞がさらに凝集し、細胞凝集体の中心にある細胞は他の細胞に囲まれて増殖していないことが示されました。したがって、娘細胞を配置するのに十分なスペースがなく、凝集体の中心に栄養と酸素が不足しているため、増殖プロセスは中止されました。

0日目から11日目までの蛍光生死アッセイキットを使用した3Dハイドロゲル構築物内のMDA-MB-231細胞の生存率を示す顕微鏡画像。生細胞と死細胞はそれぞれカルセイン-AMおよびPIを使用して染色されました（緑色は生細胞を表します） ; 赤い色は死んだ細胞を表します)。レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化した。スケールバー、50 μm (拡大画像、スケールバー、30 μm)。

3D バイオプリント構築物内のカプセル化 MDA-MB-231 細胞の Ki-67 染色。 Alexa Fluor 546およびHoechst 33,342で可視化した抗Ki-67抗体を使用して細胞を染色しました(赤色はki-67陽性の細胞を表し、青色はすべての細胞を表します)。レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化した。スケールバー、50 μm (拡大画像、スケールバー、30 μm)。

インビトロ実験の結果は、開発された数学モデルをパラメータ化するために適用されました。

3D バイオプリンティング技術を他の 3D 細胞培養技術よりも優れたものにする重要な特性は、作成された構造を正確に制御できることです。この特性により、多孔性、透過性、剛性などの制御された構造的および機械的特性を備えた生体模倣構造を高解像度で作製する機会が得られます24、25、26。ただし、足場内でのプリンティング後の細胞の挙動の分析は、さまざまな in vitro 測定の実行にのみ依存します。 3D バイオプリント構造における細胞の挙動のいくつかの側面を実験的に測定することは、細胞間相互作用や細胞と微小環境の相互作用を定義するなどの正確な定量的手法が不足しているため、困難です。この問題は、足場内でのプリンティング後の細胞の挙動をシミュレートするための数学的フレームワークの開発の動機となりました。このフレームワークは、これらの課題を克服するだけでなく、実験を繰り返すことなくプリント後の細胞機能を正確に設計し、予測する必要があります。

セルオートマトンを使用した個体ベースのモデリングは、細胞レベルで細胞増殖の空間的および時間的メカニズムをシミュレートする 1 つの方法です 27,28。このアプローチは、セルのグリッドを含む動的システムであり、各セルには離散状態のセットがあります29。 CA モデリングは、さまざまな静的オートマトン規則に基づいてさまざまながん細胞のメカニズムを調査するために近年広く使用されています 30。しかし、これまでのところ、3D バイオプリンティングを使用したがん細胞の 3D 培養に CA モデリングを適用した研究はありません。 3D バイオプリント構造にカプセル化された細胞増殖をシミュレーションするこの研究では、3D プリント構造の空間特性を捕捉する能力と、さまざまな仮説を探索する柔軟性のため、この数学的手法を選択しました。さらに、私たちの in vitro 実験から得られたデータには離散的な形式の細胞が含まれていたため、この離散的な数学的手法によりこのプロセスをより正確にシミュレーションできるようになります。この研究で開発されたフレームワークは、細胞の増殖、生存能力、運動、およびヒドロゲルと隣接細胞、およびヒドロゲルネットワーク内のクラスター形成を含む環境との相互作用における規則を表しています。この記事で示したインシリコの結果は、n = 100 回のシミュレーション実行からの平均値と標準偏差に基づいています。ここで、n は一貫性分析によって動機付けられています (補足資料、一貫性分析)。

図 5 は、インビトロとインシリコの両方の足場内での 11 日間の細胞増殖パターンを示しており、それらが互いに一致していることを示しています。細胞増殖では、初期細胞密度と足場容量が 2 つの重要なパラメーターであり、それぞれ \({C}_{\mathrm{initial}}\) と \(C\) 変数として指定しました。これらのパラメータの対応する値は、インビトロ研究に最もよく適合するようにキャリブレーションを使用して決定されました。開発されたモデルの初期細胞密度は、足場内の細胞の総数ではなく、薄層内で相互作用できる細胞の有効な初期集団を表すことに注意してください。したがって、シミュレートされた細胞密度は、実験設定での細胞密度と比較してスケール係数によって減少しました。結果は、シミュレーションと実験の両方で、細胞が 7 日後に最大細胞密度に達したことを示しました。細胞が足場内で最大密度に達するまでにかかる時間は、初期細胞の数と印刷された足場の容量に大きく依存していました。初期細胞の数が多く、足場容量が少ないほど、細胞はより早く最大細胞密度に達し、増殖が停止します。したがって、これらのパラメーターを微調整し、さまざまなシナリオでシミュレーションを実行することで、研究者は、in vitro アッセイを繰り返すことなく、望ましい結果が得られる実験を設計できます。

3D ハイドロゲルネットワーク内での MDA-MB-231 細胞増殖のインビトロ結果とインシリコ結果の比較。エラーバーは±SD、n ≥ 3を表します。

シミュレートされたデータは、生存率と増殖の実験結果を一貫して再現することもできました。前のセクションで説明したように、細胞は印刷後 7 日以内に約 99% の生存率を示しましたが、細胞の大部分が休止期にあった 7 日目から 11 日目にかけて死んだ細胞の数がわずかに増加しました。したがって、in vitro 条件を正確にシミュレートするために、確率数 (\({C}_{d}\)) で定義される指定された時間を超えて長時間定常期に留まった細胞が、定常期を開始すると仮定しました。指定された確率 (\({P}_{d}\)) で死亡します。この観察は、細胞が細胞定常期に入った後に細胞周期に再び入ることができないことによって生物学的に説明できます。

図 5 は、ハイドロゲルネットワーク内で成長するインシリコ MDA-MB-231 細胞のスナップショットを示しています。 3D 構造の細胞の体外顕微鏡画像も表示されます。この図では、in vitro と in silico の両方で、0、4、7、11 日目の細胞の分布と細胞クラスター形成の進行を見ることができます。インシリコ画像では、黄色、赤色、黒色の細胞はそれぞれ増殖細胞、非増殖細胞、死滅細胞を表しています。

0日目には、いくつかの細胞がヒドロゲルネットワーク内に分布していました。時間の経過とともに、細胞は増殖し、最初は 2 つの細胞からなるクラスターを作成し、次により大きなクラスターを作成しました。インビトロ観察と同様に、生存率の割合は 11 日目まで約 100% を維持しましたが、その後生存率はわずかに減少し、93.74 ± 0.5% に達しました。さらに、シミュレートされた細胞増殖は時間の経過とともに減少し、7 日後には足場の最大能力に達したために大幅に減少しました。 11 日目のヒドロゲル足場内の細胞増殖のアニメーションも補足資料 (図 S3) で利用できます。

細胞の生存能力と増殖以外のもう 1 つの重要な要素は、細胞が周囲のマトリックス内を移動する能力です。このシミュレーションは、実験的評価を行わずに、細胞の移動だけでなく、ハイドロゲルネットワーク内で形成された腫瘍クラスターの構造と分布を分析するためにも適用できます。腫瘍クラスターは、それらの位置と微小環境に応じて、隣接する細胞間または親細胞と娘細胞の間の相互作用によって作成される可能性があります 31。実際、細胞は細胞間の物理的相互作用およびシグナル伝達相互作用を通じて調整し、クラスターを形成します。

図 S1 (補足資料) では、特に 7 日後、必須リソースがそこでより集中しているため、細胞は足場の細孔に向かって這い、続いてそれらの細孔の周囲にクラスターを形成する傾向を示しています。この事実は、ヒドロゲルネットワークの資源輸送能力が限られていることを示唆しています。したがって、異なる細胞を考慮するために、細胞間シグナル伝達 (\({L}_{C}\)) と細胞間引力 (\({L}_{p}\)) の両方に対する特定の引力範囲を定義しました。移行の方向。移動速度もクラスターの形成に影響を与える重要なパラメーターです。ファリカら。は、材料の剛性と細胞受容体の固定の組み合わせにより、がん細胞の動きが 3D 微環境で阻害され、極めて低速であることを示しました 22。したがって、この研究と以前の研究での観察に基づいて、細胞の移動速度を校正しました。移動過程では、各個体は \({m}_{C}\) として定義される特定の時刻に、細胞の引力に基づいて決定された方向に移動しました。キャリブレーションのプロセス中に、in vitro と in silico の結果を比較することにより、細胞は、より小さい誘引範囲 (\({L}_{C}\)) 内で隣接する細胞に向かって移動する傾向が小さいと結論付けられました。足場の表面/細孔 (\({L}_{p}\))。これらのルールをモデルに適用すると (図 6)、細胞は移動とクラスター形成の点で in vitro の細胞挙動を模倣します。提案されたモデルの結果は、以前の研究の結果と一致しています 22,32。

中央のパネルは、3D ハイドロゲル構築物内での MDA-MB-321 の成長をコンピュータで視覚化します。黄色は増殖中の細胞を表します。赤は非増殖細胞を表します。黒は死んだ細胞を表します。右および左のパネルは、0日目、4日目、7日目、および11日目に位相差顕微鏡で観察した3Dヒドロゲル構築物にカプセル化されたMDA-MB-231細胞を表す:スケールバー、50μm。

一般に、このモデルは、インビトロ 3D バイオプリンティング評価と組み合わせて開発され、3D 製造構造全体の包括的な分析につながります。このシミュレーションの主な用途の 1 つは、望ましい生物学的設定を再現する能力を向上させる、未実践の微小環境におけるプリンティング後の細胞の挙動を予測することです。たとえば、このモデルは、長期にわたる細胞の挙動に対するさまざまな初期細胞密度などのさまざまな重要なパラメーターの影響を評価する機会を提供します。これは、研究者にとって、実験を繰り返すことなく細胞増殖に適した微環境を生成するのに役立ちます。例えば、細胞増殖を改善し、細胞死を減少させるために足場の能力を変更することを目的として、サイズまたは構造的形状の観点から足場を設計することができる。

インシリコモデルをさらに検証するために、2 つの異なる状況で異なる実験変数を使用してバイオプリンティング手順を実行しました。ケース 1: 初期細胞密度を変更する。ケース 2: さまざまなバイオインク配合。ケース 1 では、4% (\(w/v\)) ゼラチン、4% (\(w/v\)) アルギン酸塩、および 1.5 × 1 \({0}^{6}) を含むバイオインクを使用してバイオプリンティングを行いました。 \) MDA-MB-231 細胞 \({\mathrm{mL}}^{-1}\)。ケース 2: 最終濃度 4% (\(w/v\)) ゼラチン、5% (\(w/v\)) アルギン酸塩、および 2 × 1 \({0} ^{6}\) MDA-MB-231 細胞 \({\mathrm{mL}}^{-1}\)。校正されたインシリコモデルを使用して、これら 2 つの新しい条件における細胞の増殖パターンを予測したいと思います。

図７は、ケース１の１０日間の細胞増殖パターンをインビトロとインシリコの両方で示しており、互いに一致していることを示している。インシリコモデルでは、\({C}_{\mathrm{initial}}\) (初期細胞密度) を除くすべてのパラメーターは、キャリブレーション済みモデルと同じ値を持ちます。シミュレートされた細胞密度は、実験設定の細胞密度と比較して同じ倍率で減少し、\({C}_{\mathrm{initial}}=2000\) に設定されます。シミュレーションと実験の両方で、細胞は7日経過しても最大細胞密度に達せず、増殖し続けることが実証されました。したがって、最初の細胞の数が減少すると、後の細胞は足場能力を達成し、その結果増殖を停止しました。

ケース 1 のインシリコモデルを使用した細胞増殖の予測: 4% ゼラチン中の 1.5 × 1 \({0}^{6}\) MDA-MB-231 細胞 \({mL}^{-1}\)/ 4% アルギン酸塩バイオインク。インビトロ研究は、MTT アッセイを使用して実行されました。エラーバーは±SD、n ≥ 3を表します。

ケース 2 の in vitro と in silico の細胞増殖パターンを比較した図 8 も一致を示しています。この場合、実験的にバイオインクの配合を変更しました。先に実証したように、アルギン酸塩の濃度を高めると、ヒドロゲルベースの構造の剛性が高まる可能性があります 33。また、微小環境の剛性が足場内の細胞の移動とスフェロイドの形成にも影響を与えることもわかっています 34。剛性に直接関連するパラメーターはまだモデルに組み込まれていませんが、細胞の動きのいくつかのルールを変えることによって、細胞の挙動を調節し、バイオインクの配合と剛性が増殖と移動に及ぼす影響を調査できる可能性があります。 4% (w/v) ゼラチンと 4% (w/v) アルギン酸塩を含むバイオインクの校正モデルでは、細胞は 15 時間ごとに移動し、\({m}_{c}\) で示されます。したがって、4% (w/v) ゼラチン、5% (w/v) アルギン酸塩ベースのバイオインクを使用すると、より硬い微小環境にカプセル化された細胞の移動速度が低下し、 \({m}_{c}\) が次のように変化します。他のパラメーターを変更せずに 20 時間。インシリコモデルの結果をインビトロデータと比較すると、4% (w/v) ゼラチンと 5% (w/v) アルギン酸塩ベースのバイオインクでは \({m}_{c}\ )=20 時間は、11 日以内のインビトロ増殖傾向とほぼ一致します。

ケース 2 のインシリコモデルを使用した細胞増殖の予測: 4% ゼラチン/5% アルギン酸塩バイオインク中の 2 × 1 \({0}^{6}\) 細胞 \({mL}^{-1}\)。インビトロ研究は、MTT アッセイを使用して実行されました。エラーバーは±SD、n ≥ 3を表します。

インビトロ観察により、11日目に細胞増殖がわずかに減少したことが明らかになりましたが、これは微小環境がより硬いことによって説明できます。実際、剛性により細胞の移動と増殖が減少する可能性があります。栄養素の輸送が妨げられ、時間が経つと細胞死が起こります。バイオインク配合をより大幅に変更するには、細胞の挙動を正確に予測するために、微小環境の剛性またはバイオインク関連のパラメーターをモデルに組み込む必要があります。ただし、ゼラチン 4% (\(w/v\))、アルギン酸 5% (\(w/v\)) を使用し、バイオインク配合に若干の変更を加えることで、開発したモデルを問題なく使用できます。

まとめると、in vitro データにバリエーションを作成し、さまざまな状況をうまくシミュレートすることでモデルを検証できました。したがって、このモデルは研究者が結果を予測することでより正確に実験を計画するのに役立つと自信を持って主張できます。実際、研究者は、さまざまな状況下でシミュレーションを実行し、関連パラメーターを微調整することで、in vitro 手順を繰り返すことなく、望ましい結果に到達する実験を設計できます。

この研究で開発された数学的枠組みは、そのルールを拡張し、生物学的システムの正確な予測を提供する能力を向上させることにより、組織工学、腫瘍学、製薬産業などのさまざまな用途のさまざまなバイオプリンティング関連の研究に幅広く適用できます。私たちのモデルは、3D ネットワークへの増殖や移動、酸素/栄養素の拡散などの細胞の挙動を制御する剛性や構造的完全性などのバイオインク関連パラメーターを組み込むことで拡張できます 35,36,37,38,39。

さらに、提案されたモデルは機械学習アルゴリズムと統合でき、研究者に生物学的システムの任意の目的に対するヒドロゲルネットワークの時間的または構造的影響を予測する機会を提供します。さらに、CA シミュレーションを使用して ML アルゴリズムを事前トレーニングし、転移学習アプローチを適用して実験データをトレーニングできます。

このモデルのもう 1 つの展望は、細胞間相互作用および細胞 ECM 相互作用を研究するための、複数の細胞株を含む不均一環境での応用です。さらに、ルールを調整することで、このモデルを薬物動態モデリング技術と統合し、3D バイオプリンティングを使用して 3D 細胞培養における薬物治療反応をシミュレートし、腫瘍の発生と転移、薬物スクリーニング、およびがん研究のその他の側面の研究に役立てることができます。

最終的に、この研究、または他のモデリング技術との組み合わせは、将来の 3D バイオプリンティングの開発に大きな影響を与え、費用と時間のかかる実験の実施を大幅に回避できると私たちは信じています。

これまでのところ、3Dバイオリンティングハイドロゲル内で増殖する細胞の最適なプリント後の挙動は、時間と費用がかかるいくつかの実験を繰り返すだけで達成されています。この課題を克服するために、私たちは 3D バイオプリント構造内でのプリント後の細胞のダイナミクスをシミュレートする CA モデルを開発しました。この目的を達成するために、まず MDA-MB-231/ゼラチン/アルギン酸塩バイオインクの印刷に成功し、MTT、生死細胞、および Ki-67 細胞増殖アッセイを使用して 11 日間で細胞の挙動を評価しました。 in vitro の結果を使用して、3D ハイドロゲルネットワーク内での細胞増殖、生存率、移動、およびクラスター形成に関する CA モデルのルールを定義し、倍加時間、移動速度、11 日以内の死亡確率などのモデルパラメーターを校正しました。私たちのモデルは、3D 足場内の細胞のプリンティング後の in vitro 挙動を定量的に捉えることができ、さまざまなバイオプリンティング条件での細胞の挙動を予測して解明することができます。たとえば、細胞の動きや細胞が毛穴に向かって這い、7日後には栄養素と酸素の不均一な分布によりクラスターが形成される様子を再現します。さらに、インシリコデータは、細胞増殖の初期細胞数と印刷されたハイドロゲルネットワークの容量への依存性を解明し、バイオインク中の細胞の初期量に基づいて印刷後の細胞増殖を予測できます。このインシリコモデルは、ゼラチンとアルギン酸塩を含むさまざまなネットワーク配合物を使用して細胞活動を表現することもできます。提案された数学的枠組みは、研究者にとって、実験を繰り返す必要なく、細胞増殖により適した微環境を生成するのに役立ちます。したがって、私たちの数学的枠組みは、バイオプリンティング関連の研究の進歩に関わるリソース豊富なステップと考えることができます。

アルギン酸ナトリウム塩、ジメチルスルホキシド (DMSO)、塩化ナトリウム、塩化カルシウム (CaCl2)、およびウシ皮膚 (タイプ B) のゼラチンは、Sigma-Aldrich (カナダ) から入手しました。細胞培養研究では、MDA-MB-231 を ATCC から購入し、DMEM (ダルベッコ改変イーグル培地)、FBS (ウシ胎児血清)、ペニシリン/ストレプトマイシン、0.25% (w./v.) のトリプシン/EDTA 溶液、およびリン酸塩を購入しました。緩衝食塩水 (PBS) 錠剤は Wisent Bioproducts から購入しました。 (3-(4,5-ジメチル-2-チアゾール)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド) MTT 粉末、Triton X-100、BSA (ウシ血清アルブミン)、およびパラホルムアルデヒドは Sigma-Aldrich (カナダ) から購入しました。）。さらに、生細胞／死細胞生存率アッセイキット（ＣＢＡ４１５）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＮｕｃｌｅｉＤｙｅをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カナダ）から提供した。さらに、抗 Ki67 抗体 (ab15580)、Alexa Fluor 546 ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) をそれぞれ Abcam および Invitrogen (カナダ) から購入しました。

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、Ｔ－７５フラスコ中の１０％ＦＢＳおよび１％１００Ｕｍｌ－１ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞は 5% CO2、37 °C でインキュベートされ、培地は 1 日おきに交換されました。細胞が８０％コンフルエントに達したとき、細胞をＤＰＢＳで２回リンスし、次いでトリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％〜１×）で懸濁した。

バイオインクを調製するために、Ouyang et al.38 が提供するプロトコールに従って、最初に脱イオン水を使用して 0.5% NaCl 溶液を調製しました。次いで、ゼラチンおよびアルギン酸ナトリウム塩粉末を加え、溶液を１時間激しく撹拌した。調製した溶液は70℃で加熱滅菌（30分間、3回）し、使用前に4℃に保った。バイオプリンティングの前に、混合シリンジを使用して MDA-MB-231 懸濁液を調製したゼラチン/アルギン酸塩溶液と穏やかかつ均一に混合し、最終濃度 4% (\(w/v\)) ゼラチン、4% (\ (w/v\)) アルギン酸塩と 2～2.5 × 1 \({0}^{6}\) MDA-MB-231 細胞 \({\mathrm{mL}}^{-1}\)。

バイオプリンティングは、CELLINK INCREDIBLE + 押し出しベースのバイオプリンターを使用して実行されました。調製したバイオインクを針を使用して押し出し、3D 細胞ヒドロゲル層状グリッド構造を作製しました。具体的には、この実験に適用した印刷ノズルは標準的な円錐ノズル（22G）であり、ニードルの移動速度は 5 \(mm{s}^{-1}\) に調整されました。印刷は室温で適切な圧力を加えて行われました。この構造は、Solidwork ソフトウェアを使用して設計され、sli3r ソフトウェアで、直線的な充填パターンで \(10\times 10\times 3 m{m}^{3}\) のサイズの 10 層にスライスされました。印刷中、細胞の生存率へのダメージを最小限に抑えるために、圧力を最小限のレベルに維持するよう努めました。続いて、アルギン酸ナトリウムをカルシウムイオンで架橋するために、細胞を含む構築物を 3% (\(w/v\)) の滅菌塩化カルシウム溶液に浸漬しました (20 分間)。その後、PBSで3回洗浄した後、12ウェルプレートにて10% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地で培養し、5% CO2、37℃で所定時間インキュベートした。培地は一日おきに交換した。

3D ネットワーク内の細胞増殖は、MTT アッセイを使用してアッセイされました。所定の日数のインキュベーション後、3D 構造を含む 12 ウェルプレートの各ウェルの培地を除去し、900 \(\μ L\) の新しい培地と 100 \(\μ L\) の MTT 溶液 (0.5 \( PBS 中の {\mathrm{mg }mL}^{-1}\)) を各ウェルに添加し、プレートを \({\mathrm{CO}}_{2 }\) インキュベーター。コントロールは細胞のない 3D 構造でした。次に、培地を吸引した後、1 \(mL\) の DMSO を各ウェルに加え、\({\mathrm{CO}}_{2}\) インキュベーター内で 37 °C で 30 分間、形成されたホルマザン結晶を溶解しました。。最後に、可溶化されたホルマザン結晶の強度を、吸光度マイクロプレートリーダーを使用して540 nmで記録しました。

3D バイオプリントされた細胞を含む構築物は、細胞生存率を決定するための製造元の指示に基づいて Live/Dead 染色生存率キットを使用して特定の時点で染色されました。簡単に言うと、各構築物をＰＢＳ中で３回洗浄した。次に、1 \(\μ M\) のカルセイン AM と 2 \(\μ M\) のヨウ化プロピジウムを適用して、暗所でインキュベートしながら細胞を染色しました。レーザー走査型共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM 700) を使用して、3D 構造内の生細胞と死細胞を複数のスポットでイメージングしました。次に、ImageJ ソフトウェアを使用して画像を分析しました。細胞生存率は、各画像内の緑色 (生存) 細胞の数を細胞の総数で割ることによってカウントされました。

Ki-67 細胞増殖アッセイは、in vitro で細胞増殖を評価する定量的手法です。この方法を使用すると、Ki-67 タンパク質は活動的な細胞周期 (G1、S、G2、および M) では発現されるが、定常期 (G0) では発現されないため、細胞増殖のマーカーとして適用されます。このエッセイを行うために、まず、所定の時間ステップで各ウェルの培地を完全に除去し、各足場を PBS で 2 回洗浄しました。次に、足場を室温で 1 時間、PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド中でインキュベートすることによって細胞を固定しました。固定構造を PBS で 2 回洗浄した後、0.1 ～ 0.25% Triton X-100 を含む PBS で 15 分間透過処理しました。その後、細胞を PBS 中の 3% BSA/0.1% Triton X-100 で 1 時間ブロックした後、濃度 5 \({\mathrm{\mu gmL}}^{-1}) の抗 Ki67 抗体を添加しました。 \) PBS/1% BSA に溶解し、4 °C で一晩インキュベートします。次に、3D 構造を PBS/1% BSA で 5 分間 3 回洗浄した後、ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) 二次抗体を添加し、2 時間インキュベートしました。次に、Hoechst 33,342 を添加する前に、構造を PBS/BSA で再洗浄 (5 分間 2 回) しました (1 時間のインキュベーション)。最終的に、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化しました。

このモデルは、時間を離散的で均一な時間ステップとしてシミュレートします。各時間ステップは 1 時間で、各シミュレーションは 11 日間続きます。 3D バイオプリンティング法を使用して作製された多孔質細胞を含む足場のサブドメインは、このモデルでシミュレートされます。このモデルは、4 つの細孔から対称的に構成される 190 \(\times \) 190 \(\times 30\) 格子点の正方格子で構成されます。幅は 50 \(\times \) 50 \(\times 30\) の格子点です。ヒドロゲル内の各格子点は細胞によって占有されているか、空のままであることができますが、対応する in vitro 実験の細胞は細孔内に移動しないため、細孔内の格子点は占有されていないままでなければなりません（補足資料、図S2）。。シミュレーションは、ヒドロゲル内の格子上のランダムな位置に指定された初期数のセルを配置することによってインスタンス化されます。各タイムステップで、細胞は、増殖、移動、死などの細胞プロセスを記述する一連の確率的規則に従って動作します。バイオプリンティングの各時間ステップ内のプロセスの主なアルゴリズムとスケジュールを図 9 に示します。計算フレームワークは、以前の理論的な細胞集団研究に基づいて構築されています 40,41。概要、設計概念および詳細 (ODD) プロトコルを使用して定式化されたモデルの詳細な説明は、補足資料 (補足資料、インシリコ研究) で提供されます。

インビトロおよびインシリコバイオプリンティングの主なステップ。

このプロセスは、セル間のばらつきを考慮するために、各セルに対して個別にシミュレートされます。個々の細胞は、特定の確率的倍加時間によって特徴付けられます。これは、各細胞が分裂するための 1 細胞周期を完了するのにかかる時間に起因します。実験データに基づいて、各セルの倍加時間は、値 μ = 96 時間、標準偏差 σ = 6 時間の正規分布から選択されます。モデル化された増殖における細胞周期プロセスは、増殖期と非増殖 (G0) 期の間の移行で構成されます。分裂後、親セルは現在の位置に残り、娘セルは親セルの近くの空いている格子点に配置できます。隣接するすべての部位がすでに占有されている場合、親細胞は休止期または静止期として知られる G0 期に入り、細胞は不活性になります 42。娘セルの配置には、1 次、2 次、および 3 次のムーア近傍が使用されます。足場には細胞を収容するための指定された最大収容能力 \(C\) があり、細胞の総数がこの収容能力に達すると、指定された確率 (\({P}_{0}\)) で増殖が中止されます。収容力は、in vitro システムの空間および栄養素の制限によって異なります。 \(C\) と \({P}_{0}\) の値は、体外観察に従って校正されます。足場内の栄養素と酸素の分布が不均一であるため、一部の細胞は足場の収容能力に達した後も増殖することができますが、他の細胞は G0 期に入ります。これは、細胞が十分な栄養素と自由な隣接する格子点のある場所で増殖し続けることができることを意味します。表 S1 には、すべてのインシリコパラメータの値が含まれています。

移動プロセスでは、細胞は \({m}_{c}\) と呼ばれる特定の時間ごとに移動しますが、すべての細胞の動きが同期していない可能性があるため、\({m} に加算される乱数が導入されました) _{c}\)。 \({m}_{c}\) パラメーターの値も、in-vitro データを使用して校正されました。このプロセスでは、個々のセルは、ランダムな確率でランダムな方法で移動することも、バイアスされた確率でバイアスされたランダムな方法で移動することもでき、近隣に空き格子点がある場合は位置を変更することができます34。セルは、その近傍の 6 つの方向 (右、左、上、下、前、後) のいずれかに向かって等しい確率で移動することができます。これはランダム移動として知られており、重み付き確率でバイアスされたランダムな方法で移動します。インビトロ実験からの経験的観察によって動機付けられるように、他の細胞およびその近傍の細孔に引き寄せられます。偏りのあるランダムな動きでは、引力の範囲内でセルのその方向に隣接するセルの数に応じて、各方向 (方向 p) への動きの確率を計算します。(\({L}_{ c}\))。また、各方向の確率は、(\({L}_{p}\)) として知られる特定の引力範囲内の個人と毛穴の間のユークリッド距離に応じて増加します。ランダムな動きの場合、 \({P}_{\mathrm{up}}={P}_{\mathrm{down}}={P}_{\mathrm{left}}={P}_{\ mathrm{right}}={P}_{\mathrm{forward}}={P}_{\mathrm{backward}}=1/6\)、6 は方向の数、\({P} _{\mathrm{up}}\)、\({P}_{\mathrm{down}}\)、\({P}_{\mathrm{left}}\) \({P}_{\ mathrm{right}}\) 、 \({P}_{forward}\) 、および \({P}_{\mathrm{backward}}\) は、セルが上下左右に移動する確率です。それぞれ右方向。ランダムバイアスの場合、\({P}_{\mathrm{up}}={P}_{1}\)、\({P}_{\mathrm{down}}={P}_{ 2}\)、\({P}_{\mathrm{right}}={P}_{3}\)、\({P}_{\mathrm{left}}={P}_{4} \)、\({P}_{forward}={P}_{5}\)、\({P}_{backward}={P}_{6}\)、\({\sum }_{i=1}^{6}{P}_{i}=1\)。確率 \({P}_{i}\) は、隣接するセルと細孔格子点をスキャンして合計することによって計算されます。詳細については、補足資料で説明されています。最後に、各セルは、より高い確率が計算される方向に、より多くの傾向で移動します。

シミュレーションでは、3D バイオプリント足場の多孔質構造により、すべての細胞が栄養素と酸素にアクセスできるようになり、そのような重要な物質の欠如による細胞死が防止されると仮定しました。ただし、\({C}_{d}\) として定義される特定の時間以上定常期に留まると、細胞は生存能力を失います。値の範囲内で調整され、\({P}_ の確率で計算されます) {d}\)。表 S1 には、すべてのインシリコパラメータの値が含まれています。

Image Jソフトウェアを利用して画像を分析した。図および報告されたデータのすべてのエラーバーは、少なくとも 3 回の繰り返し (n ≥ 3) からの ± SD を示しました。結果は平均値 ± SD の形式で報告されました。共焦点顕微鏡画像から報告された統計は、各構造の少なくとも 5 つの異なる点の細胞数を平均することによって得られました。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて、責任著者である Dorsa Mohammadrezaei から入手できます。

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サラ・ハミス

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DM: 分析を考案および設計し、インシリココードを開発し、インビトロおよびインシリコ実験を実行および分析し、原稿を起草しました。 NM: インビトロ実験についてアドバイスしました。 SV: インシリコ実験を実施。 GP: 分析を考案および設計し、プロジェクトにアドバイスし、原稿を修正しました。 SH: 研究を考案および設計し、コンピュータ実験に助言し、計算フレームワークを開発し、原稿を改訂しました。 MK: 分析を考案および設計し、プロジェクトを監督し、原稿を改訂しました。

ドルサ・モハマドレザエイへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足事項１．

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受信日: 2022 年 8 月 13 日

受理日: 2023 年 1 月 16 日

公開日: 2023 年 1 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28286-9

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