P(3HB の統計的最適化

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9005 (2023) この記事を引用

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ポリ(3-ヒドロキシ酪酸-co-3-ヒドロキシヘキサノエート) [P(3HB-co-3HHx)] は、次世代バイオプラスチックであるポリヒドロキシアルカノエート (PHA) ファミリーの細菌コポリマーです。 私たちの研究チームは最近、新たに P(3HB-co-3HHx) を産生する細菌株、Cupriavidus necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp を操作しました。 この株は、唯一の炭素基質として粗パーム核油 (CPKO) を使用して P(3HB-co-2 mol% 3HHx) を生成できます。 しかし、この菌株による P(3HB-co-3HHx) コポリマー生産の改善はこれまで研究されていません。 したがって、この研究は、応答曲面法 (RSM) を使用して、より高い 3HHx モノマー組成を含む P(3HB-co-3HHx) コポリマーの生産を強化することを目的としています。 P(3HB-co-3HHx) コポリマー生成の 3 つの重要な要素、つまり CPKO 濃度、ヘキサン酸ナトリウム濃度、および培養時間をフラスコ スケールで研究しました。 その結果、RSM 最適化条件を使用して、4 mol% 3HHx 組成を含む最大 3.6 ± 0.4 g/L の P(3HB-co-3HHx) が得られました。 同様に、10L 撹拌バイオリアクターで発酵をスケールアップすると、より高い 3HHx モノマー組成 (5 mol%) が得られました。 さらに、生成したポリマーの特性は市販の P(3HB-co-3HHx) と類似しており、このポリマーは幅広い用途に適しています。

プラスチック汚染は、最も重大な地球環境問題の 1 つとして浮上しています。 明らかに、新型コロナウイルス感染症のパンデミックは、手袋、医療用防護服、マスク、手指消毒剤ボトル、持ち帰り用プラスチック、食品容器、医療検査キットなど、石油ベースの使い捨てプラスチックの大幅な急増に貢献しています1、2。 これらの従来のプラスチックは生分解性ではなく、埋め立て地や海洋に長年残留する可能性があり、土壌の品質、微生物の活動、動植物に大きな影響を与えます3。 食物連鎖に入ると、人間の健康にリスクが生じます4。 こうした懸念から、環境への影響がほとんどまたはまったくない生分解性プラスチックが、石油由来のプラスチックの代替品として人気を集めています。 さらに、それらは国連の持続可能な開発目標（SDGs）5、6の側面の達成を助ける将来の循環経済の一部となることが期待されています。

ポリヒドロキシアルカノエート (PHA) は、ストレス条件下で一部の細菌や古細菌によってエネルギー貯蔵として蓄積される細胞内貯蔵化合物として自然界で生成されるポリエステルです 7,8。 PHA は、ポリプロピレン (PP) やポリエチレン (PE) などの従来の石油ベースのポリマーに匹敵する特性を持つ熱可塑性プラスチックです9,10。 興味深いことに、PHA ファミリーのポリマーは海水にさらされた場合でも優れた生分解性を示し 11、PHA は石油ベースのプラスチックの有望な代替品となっています。 PHA は、モノマー構成成分の炭素数に基づいて 2 つのグループに分類されます。1 つは 3 ～ 5 個の炭素モノマーからなる短鎖長 PHA (SCL-PHA、C3-C5)、もう 1 つは中鎖長 PHA (MCL) です。 -PHA、C6-C14)、3-ヒドロキシアルカノエート単位の 6 ～ 14 個の炭素モノマーから構成されます 12、13。

現在、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸) [P(3HB]、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸-co-4-ヒドロキシ酪酸) [P(3HB-co) などのホモポリマーおよびコポリマーを含む 150 種類を超える PHA が確認されています 14。 -4HB)]、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸-co-3-ヒドロキシ吉草酸) [P(3HB-co-3HV)]、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸-co-3-ヒドロキシヘキソネート) [P(3HB-co-3HHx)] PHA コポリマーの中でも、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸-co-3-ヒドロキシ ヘキサノエート) [P(3HB-co-3HHx)] は、優れた柔軟性と、さまざまな一般的な石油ベースのポリマーに類似しているため、特に望ましいものです。 P(3HB-co-3HHx) は、硬い P(3HB) ホモポリマーよりも実用的な用途に適用できます 15,16。さらに、その優れた生体適合性と生分解性により、P(3HB-co-3HHx) は生物医学用途に適したコポリマー候補です 17。

それにもかかわらず、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）の商業利用は、競合する石油化学ポリマーと比較して比較的高い製造コストによって制約されてきました。 したがって、発酵培地の改善は、細胞の増殖と望ましい代謝産物の発現の両方に大きな影響を与え、全体の生産性に貢献するため、重要な研究分野となっています18。 応答曲面法 (RSM) は、プロセスの歩留まりを最適化し、応答の動作を指定するための主要な応答曲面設計である、中央複合計画 (CCD) やボックス ベンケン計画 (BBD) などの実験要因計画を採用する統計的最適化アプローチです。指定された設計空間内で。 どちらの設計も、製品開発に大きな影響を与える要素の相互作用の影響を調査しています。 CCD および BBD の実験実行は、プロセス パラメータを結果に関連付ける数学的モデルを確立するために RSM に使用されます21。 ただし、BBD は通常、CCD よりも必要な設計ポイントが少ないため、回帰モデルの品質が低下する可能性があります。

さまざまな細菌由来の PHA 合成酵素をコードする遺伝子を備えた組換え PHA 生産株は、短鎖長から中鎖長 (SCL-MCL) PHA をより効果的に生成するために開発されています 22。 私たちの研究グループは最近、新しい P(3HB-co-3HHx) 産生細菌株、C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp23,24 を操作しました。 この株は、唯一の炭素源として 10 g/L の粗パーム核油 (CPKO) を使用した場合、2 mol% の 3HHx モノマー組成を含む P(3HB-co-3HHx) コポリマーを 3.1 ± 0.3 g/L 生成しました 24。 ただし、P(3HB-co-3HHx) の収量を最大化するには、この株による PHA 生産の最適な培地と条件を改善する必要があります。 したがって、この研究は、RSM を使用して C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp の発酵条件を最適化し、P(3HB-co-3HHx) 生成を改善することを目的としています。 さらに、P(3HB-co-3HHx) の生産をスケールアップするために、発酵を 10 L 撹拌タンク バイオリアクターで実行しました。 最後に、このポリマーの特性を評価し、このポリマーがさまざまな用途に有望であることを確認しました。

P(3HB-co-3HHx)生産のための最適な培地組成と培養条件、および各パラメーターの相互作用効果は、3変数5レベルCCD設計を使用して決定されました。 CCD 変数には、CPKO 濃度、g/L(X1)、ヘキサン酸ナトリウム濃度、g/L(X2)、および培養時間、h(X3) が含まれます。 P(3HB-co-3HHx) 生成および予測される応答の実験結果を表 1 に示します。結果から、最高の P(3HB-co-3HHx) 生成 (実行 6) である 3.54 g/L が達成されたことが明らかになりました。 CPKO、ヘキサン酸ナトリウムの濃度、および培養時間は、それぞれ15 g/L、1.0 g/L、および54時間であった。 一方、CPKO、ヘキサン酸ナトリウムの濃度、および培養時間がそれぞれ5 g/L、3.0 g/L、および42時間の場合、P(3HB-co-3HHx)生成量(実行3)は0.53 g/Lでした。 重回帰分析からの CCD 実験出力は、2 次多項式モデルに適合されました。 次のモデルを使用して、コード化された変数に関して P(3HB-co-3HHx) 生成を適合させました。

ここで、Y は P(3HB-co-3HHx) 生産量、X1、X2、および X3 はそれぞれ CPKO、ヘキサン酸ナトリウム、および培養時間のコード化された値です。

応答曲面二次モデルの F 検定と分散分析により、方程式の統計的有意性が確認されました。 R2 = 0.9885 がこの研究の回帰式の決定係数でした (表 2)。 結果として、このモデルは従属変数の変動の約 98.85% を説明できます。 残りの 1.15% は他の要因の影響を受けました。 一方、サンプル サイズと項数 25 を考慮した修正 R2 は 0.9782 でした。 R2 値は常に 0 から 1 の間です。R2 が大きいほど、モデルの影響力が大きくなり、応答をより正確に予測します21。 P 値は各係数の有意性を評価するために使用され、変数間の相互作用のパターンを理解するのに役立ちます26。 対応する係数 27 の有意性が強いほど、P 値は小さくなります。 表 2 に示すように、F 検定と対応する P 値が推定されました。モデルは、一定の線形 (X1、X2、X3)、二次関数 (X12、X22、X32)、および交互作用項 (X1X3 および X2X3) が次のことを示しています。は有意である (P < 0.05) (表 2)。 ただし、すべての変数 (X1、X2、および X3) の P 値が 0.0001 より小さいため、どの変数が P(3HB-co-3HHx) 生成にとって最も重要であるかをほとんど示しません。

このモデルの相互作用項の多項式係数が負であることは、相互作用が反対であることを示唆しています。 1.26 という不適合 F 値 (表 2) は、不適合が標準誤差と比較して統計的に有意ではないことを示しています。 この高い不適合 F 値は、ノイズによって 40.36% の確率で発生します。

異なるパラメーター間の相互作用を評価し、最大の P(3HB-co-3HHx) 生成に対する各パラメーターの最適値を決定するために、CPKO (X1)、ヘキサン酸ナトリウム (X2) および培養時間 CPKO (X3) 間の応答をプロットしました。図 1A は、P(3HB-co-3HHx) 生成に対する CPKO とヘキサン酸ナトリウムの影響を示しています。 CPKO 濃度が 5.0 から 15.0 g/L に増加すると、P(3HB-co-3HHx) の生成が増加しました。 より低い CPKO 濃度 (< 5.0 g/L) では、P(3HB-co-3HHx) 生成が減少しました。 一方、P(3HB-co-3HHx) の生成は、ヘキサン酸ナトリウム濃度が 3.0 g/L から 1.0 g/L に減少するにつれて増加しました。 ヘキサン酸ナトリウム濃度が高くなると (> 3.0 g/L)、P(3HB-co-3HHx) の生成は劇的に減少しました。

モデルによって記述された応答曲面および等高線プロットは、CPKO、ヘキサン酸ナトリウム、C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp による培養時間の値として P(3HB-co-3HHx) 生成 (g/L) を表します。 CPKO とヘキサン酸ナトリウムの併用効果 (A); CPKO と培養時間 (B); ヘキサン酸ナトリウムと培養時間 (C)。

P(3HB-co-3HHx)生産に関するCPKO(X1)および培養時間(X2)のRSM 3Dグラフおよび2D等高線プロット(図1B)によると、P(3HB-co-3HHx)がCPKO を 5.0 g/L から 15.0 g/L に増加すると、生産量が大幅に向上しました。 同時に、CPKO 濃度が 5.0 g/L 未満に低下すると、それは減少しました。 さらに、培養時間を54時間から42時間に短縮すると、P(3HB-co-3HHx)の生産量が増加した。 それにもかかわらず、培養時間が増加するにつれて (> 54 時間)、P(3HB-co-3HHx) 生成は劇的に減少しました。

ヘキサン酸ナトリウムと培養時間の効果を図 1C に示します。 P(3HB-co-3HHx) の生成は、ヘキサン酸ナトリウムを 3.0 g/L から 1.0 g/L に減少させると増加しました。 P(3HB-co-3HHx) の生成は、ヘキサン酸ナトリウムの濃度が高くなると (> 3.0 g/L) 劇的に減少し、42 時間から 54 時間までの長時間に応じて増加しました。 さらに、培養時間が 42 時間未満の場合、P(3HB-co-3HHx) 生産は減少しました。

最適化予測を検証するために、設計空間内の 3 つの要素についてモデルが検証されました。 RSM に最適化された培地の組成と条件を 250 フラスコ規模で 3 回テストしました。 結果は、以下の条件下で、CPKO、14.4 g/L、ヘキサン酸ナトリウム、1.7 g/L、および培養時間 43 時間で、最大 P(3HB-co-3HHx) 生成量が 3.63 ± 0.4、5.54 ± であることを示しています。 ０．８ｇ／ＬのＤＣＷが得られ、予測されたＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）生成量３．５５ｇ／Ｌに近かった。 予測値と実験値を比較し、残差を計算しました。 実際の P(3HB-co-3HHx) 生成レベルと予測された P(3HB-co-3HHx) 生成レベル間の相対差は 0.3% でした。 結果として、観察されたモデルは非常に正確であり、RSM 分析は発酵培地と条件を予測および改善するための適切なアプローチです。

細胞バイオマスおよびC. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRpのP(3HB-co-3HHx)産生を増強するために、10L撹拌タンクバイオリアクター内でバッチ培養を実施した。 発酵は、6LのRSM最適化培地(CPKO、14.4g/L、ヘキサン酸ナトリウム、1.7g/L)を含むバイオリアクター内で実施した。 温度、pH、通気速度、および撹拌速度は、それぞれ 30 °C、6.8、0.25 vvm、および 200 rpm に固定しました。 C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp の増殖と P(3HB-co-3HHx) 生成は、48 時間の発酵中にゆっくりと増加しました。 図 2 に見られるように、バイオマスは発酵とともに徐々に増加しました。 しかし、発酵期間が最適値 (42 時間) を超えて延長されると、P(3HB-co-3HHx) の生成と細胞増殖が中断され、P(3HB-co-3HHx) の分解が始まりました 28。 P(3HB-co-3HHx) の生成量が最も高かったのは、DCW が 6.2 ± 0.3 g/L の 42 時間でした。 P(3HB-co-3HHx) 生成量は 3.9 ± 0.3 g/L でした (図 2)。 さらに、10L 撹拌タンクバイオリアクター内で C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp を培養すると、より高い 3HHx モノマー画分 (5 mol%) が得られたことに留意すべきである。

10L 撹拌タンクバイオリアクターにおける C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp p のバッチ発酵プロファイル。

C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp から生成された抽出 P(3HB-co-5 mol% 3HHx) コポリマーは、さらなる用途に向けてコポリマーの構造的および熱的特性を理解するために、1H NMR、FTIR、DSC、および TGA によって特性評価されました。 1H NMRを実施して、C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp株によって合成されたコポリマー中の3HHxモノマーの存在を確認した。 図 3 は、C4 メチレン基に対応する H4 の 1H NMR バンドと、C6 メチル基に対応する H6 の 1H NMR バンドを示しており、P(3HB-co-3HHx) コポリマーの形成を示しています15、24、29。 。 コポリマーのモノマー分率は、メチル成分の 1H スペクトル強度比に従って計算されました 30。 生成された 3HHx モノマー画分の値は、ガス GC 分析で観察された値よりわずかに高く、変動は 1 mol% でした。

10L 撹拌タンク バイオリアクター内で C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって生成された P(3HB-co-3HHx) のプロトン核磁気共鳴分光法 (1H NMR) スペクトル。

FTIR吸収スペクトルは4000〜400cm-1の範囲でスキャンされました。 C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって合成されたコポリマーの FTIR スペクトルを図 4 に示します。P(3HB-co-3HHx) の主な吸収ピークが 1720.98 cm-1 のスペクトルで観察されました。カルボニル (C=O) エステル結合の伸縮振動に影響します31,32。 一方、非対称の C-O-C 伸縮振動は 1269.35 cm -133 で吸収ピークを引き起こします。C-H 伸縮と -CH グループは、2976.37 cm-1 と 1221.72 ～ 1375.09 cm-1 に位置する他の特徴的なバンドで表されました。 、それぞれ34、35。 アモルファス相の場合、C-O および CC-C 伸縮振動は、1179.79 から 606.08 cm-133 の範囲の一連の吸収バンドに起因すると考えられました。

10L 撹拌タンク バイオリアクター内で C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって生成された P(3HB-co-3HHx) の減衰全反射フーリエ変換赤外分光法 (ATR-FTIR) スペクトル。

C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって生成された P(3HB-co-5 mol% 3HHx) コポリマーの熱特性を、DSC および TGA を使用して分析しました。 図 5 は、融解温度 (Tm) とガラス転移温度 (Tg) のサーモグラムを示し、図 6 はコポリマーの分解温度 (Td) を示します。 値は、前のサンプルの熱履歴を排除するために 2 回目の加熱から記録されました。 抽出されたコポリマーのサーモグラムから、約 129 ℃と 144 ℃の 2 つの融解温度 (Tm1 と Tm2) が明らかになりました (図 5)。 コポリマーの Tc、Tg、Td はそれぞれ約 89、1.6 (図 5)、および 260.6 ℃ (図 6) でした。

10L 撹拌タンクバイオリアクター内で C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって生成された P(3HB-co-3HHx) の示差走査熱量測定 (DSC) 分析。

10L 撹拌タンクバイオリアクター内で C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって生成された P(3HB-co-3HHx) の熱重量分析 (TGA)。

PHA は、窒素、リン、硫黄、酸素の栄養制限濃度や過剰な炭素源などのストレス条件下で細菌や古細菌から生成される生分解性ポリマー材料です7、8、36。 どうやら、PHA はビジネス分野だけでなく科学界でもますます重要な問題になりつつあります。 これにより、合成ポリマーの補充が可能になり、最終的には意図した循環経済が確立されます。 P(3HB-co-3HHx) は、実用的なタイプの PHA コポリマーです。 P(3HB) ホモポリマーよりも融解温度と結晶化度が低く、これは 3-ヒドロキシヘキサネート (3HHx) ユニットの長い側鎖に起因すると考えられます 37。 このコポリマーは 5 ～ 15 mol% の 3HHx で構成されており、さまざまな用途に適した弾性特性を備えています 38。

以前、Han ら。 野生型株であるエロモナス属は、PHA シンターゼを介して植物油と脂肪酸から P(3HB-co-3HHx) を生成できることを報告しました。 C4-C639。 この研究では、P(3HB-co-3HHx) コポリマーは、新しく操作された細菌株である C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp23,24 によって合成され、P(3HB-co-3HHx) の生産は、 RSM。 結果は、フラスコスケールで RSM 最適化条件を使用すると、最高の 3.6 ± 0.4 g/L の P(3HB-co-4 mol% 3HHx) が得られることを示しました。 さらに、C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRpを10Lバイオリアクターで48時間の発酵中に培養すると、3HHxモノマー組成が5mol%に増加した。 この結果は、Ouyang らによって達成された結果と同様でした 40。 彼らは、エロモナス ハイドロフィラから P(3HB-co-3HHx) を生成する振盪フラスコ実験を実施しました。この P(3HB-co-3HHx) は、基本的にグルコン酸とラウリン酸の比率を変えることによって、野生型の 15% から組換え体では 3 ～ 12% までモノマー組成を制御可能でした。 48時間の発酵で培地中の酸。 Cupriavidus sp.における P(3HB-co-3HHx) 生産を研究しました。 Volova et al.22 により、C. eutrophus B10646 は、重要なバイオマス収量 (5.6 g L-1) と、高い 3HHx モル分率を含む高含量のポリマー (60 ～ 75%) を生成する可能性があることが報告されています。適切な成長条件。 ただし、P(3HB-co-3HHx) コポリマーの物理化学的および機械的特性は、3HB/3HHx 比を調整することで変更できます。 さらに、Kawashimaら41は、phaP1Reの下流領域が、R. eutrophaにおけるPHA蓄積中に過剰発現される遺伝子を組み込むのに有利な部位であることを発見した。 また、この研究結果は、PHA 合成酵素の重合特性が PHA 顆粒の表面に共存するフェイジンの種類に影響を受け、生成する PHA ポリマー (3HB-co-3HHx) を変化させることを示しました。 フェイジンの置換は、PHA コポリエステルの組成を制御するための革新的な技術方法です。 さらに、Murugan ら 42 は、組換え C. necator Re2058/pCB113 による P(3HB-co-3HHx) の生合成のための炭素源としてパーム オレイン (PO) とフルクトースを研究しました。 唯一の炭素源として５ｇ／ＬのＰＯを利用した振盪フラスコ培養により、５．１３ｇ／Ｌの細胞乾燥重量（ＣＤＷ）、６７％のＰＨＡ／ＣＤＷ、および２７モル％の３ＨＨｘを含むコポリマーが得られた。 4 ～ 15 mol% の 3HHx モノマーを含む P(3HB-co-3HHx) の分子量は 5.47 ～ 6.85 × 105 Da の範囲であり、これは以前に報告されている値より少なくとも 2 倍でした。

この研究では、CCD を採用した RSM を適用して、フラスコ規模での P(3HB-co-3HHx) の生産を向上させました。 結果は、以下の条件下で、CPKO、14.4 g/L、ヘキサン酸ナトリウム、1.7 g/L、および培養時間 43 時間で、最大 P(3HB-co-3HHx) 生成量 3.63 ± 0.4 が得られ、それに近い値が得られたことを示しています。 RSM は、P(3HB-co-3HHx) 生成量を 3.55 g/L と予測しました。 これらの結果は、P(3HB-co-3HHx) 生成に関する RSM モデルの精度を証明しました。 さらに、最適化されていない条件と比較して、最適化培地は P(3HB-co-3HHx) および 3HHx モノマー組成の生成をそれぞれ 1.2 倍および 2 倍改善できます。 これに基づいて、P(3HB-co-3HHx) 生成の改善はわずかに存在しましたが、3HHx モノマー組成は RSM によって首尾よく強化されました。 以前、RSM は多くの微生物による PHA 生合成を改善する効果的な方法であると報告されていました 43、44、45、46、47。 しかし、P(3HB-co-3HHx) 生成を改善するための RSM の使用は限られています。

バイオリアクター内での PHA 生合成を増加させるために、さまざまな細菌によるバッチ発酵を適用することが報告されています 48、49、50、51、52。 しかし、この現在の研究では、このアプローチを使用して P(3HB-co-3HHx) 生成を増強することはできません。 3HHx モノマーの組成のみが 5 mol% に増加しましたが、これは収穫期間の短縮に関係している可能性があります。 さらに、バッチ培養は操作が簡単ですが、発酵開始時の炭素と窒素の供給濃度が制限されるため、本質的な生産性が低くなります53。 対照的に、流加発酵法は高い細胞濃度を生成し、生産性を向上させ、基質または最終生成物の阻害を軽減します54。

この研究では、5 mol% の 3HHx モノマー組成を含む P(3HB-co-3HHx) コポリマーが、炭素および前駆体としてそれぞれ CPKO およびヘキサン酸ナトリウムを使用して、操作された株 C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって合成されました。 。 コポリマーは、さらなる使用のためにコポリマーの構造的および熱的特性を理解するために抽出および特性評価されました。 1H NMR スペクトルにより、C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって合成された P(3HB-co-3HHx) コポリマー中の 3HHx モノマーの存在が確認されました。 これは、Wong ら 30 および Bhubalan ら 55 によって報告された 1H NMR スペクトルと類似していました。 また、1H NMR スペクトルから 3HHx モノマー組成を計算すると、GC 分析結果と同様に、このポリマーには 5 ～ 6 mol%の 3HHx モノマーが含まれています。 コポリマーの FTIR スペクトルは、1720.98 および 1269.35 cm-1 に P(3HB-co-3HHx) コポリマーの特徴的な吸収ピークを示しました。これは、カルボニル (C=O) エステル結合および非対称 C-O- の伸縮振動に対応します。 C 伸縮振動、それぞれ 31、32。 これらの結果から、生成したコポリマーがＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）であることが証明された。

C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp によって生成された P(3HB-co-5 mol% 3HHx) コポリマーの熱特性を、DSC および TGA を使用して分析しました。 抽出されたコポリマーの DSC サーモグラムから、約 129 ℃と 144 ℃の 2 つの融解温度 (Tm1 と Tm2) が明らかになりました。 mcl-PHA の 2 つの融解温度が検出可能であり、これは 2 つの異なる結晶相 (フェーズ I およびフェーズ II) の形成に関係している可能性があります 56。 この共重合体のＴｃ、Ｔｇ、Ｔｄはそれぞれ８９、１．６、２６０．６℃であった。 これらの結果は、Murugan らによって以前に研究された結果と類似しています 42。 彼らは、C. necator Re2058/pCB113 から生成された P(3HB-co-4 mol% 3HHx) の Tm と Tg がそれぞれ 164 ℃ と -1 ℃ であると報告しました。

P(3HB) Td は 280 °C で報告されています 56,57,58。 この研究における Td コポリマーは、3HHx モノマーの組み込みにより低くなりました。 一般に、P(3HB-co-3HHx) コポリマーは P(3HB) よりも低い Tm および Td を持ちましたが、これらの特性と 3HHx モル分率の間には識別可能な関連性はありませんでした 22。

この研究では、C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp の操作株による P(3HB-co-3HHx) コポリマーの生産が、RSM を使用して改善されました。 RSM 最適条件下では、この菌株は 4 mol% の 3HHx 組成を含む P(3HB-co-3HHx) を 3.6 ± 0.4 生産できます。 最適化されていない条件と比較して、最適化された培地は、P(3HB-co-3HHx) および 3HHx モノマー組成の生成をそれぞれ 1.2 倍および 2 倍向上させることができます。 さらに、興味深いことに、10 L 撹拌タンク バイオリアクターで発酵を操作すると、3HHx モノマー組成が 5 mol% まで増加しました。これは、最適化されていない条件より 2.5 倍高かったです。 官能基と化学構造の結果から、ポリマーが P(3HB-co-3HHx) であることが確認され、生成されたポリマーの熱特性は工業用 P(3HB-co-3HHx) と同様でした。

組換え株 C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp は、Trakunjae et al.24 の記載に従って培養されました。 簡単に説明すると、細菌株を 50 μg/mL カナマイシンを添加した栄養豊富 (NR) 寒天上で 30 °C で 24 時間培養しました。 次に、細菌コロニーの 3 つの完全なループを、50 μg/mL カナマイシンを補充した NR 培地に移し、細菌接種材料を調製しました。 その後、接種材料フラスコを 200 rpm で振盪しながら 30 °C で 8 時間、または光学密度 (OD600) が 4 に達するまでインキュベートします。

3% v/vのC. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp接種材料をP(3HB-co-3HHx)産生培地に移した。 P(3HB-co-3HHx) 生成用のミネラル培地 (MM) は、0.45 g/L の K2SO4、4.6 g/L の Na2HPO4、4.0 g/L の NaH2PO4、0.54 g/L の CO(NH2)2 から構成されました。尿素]、0.39 g/LのMgSO4、0.062 g/LのCaCl2および1 mL/Lの微量元素（TE）溶液59。 ＴＥ溶液は、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．４ｇ／Ｌから構成された。 FeSO4・7H2O、15g/L; MnSO4・H2O、2.4 g/L、およびCuSO4・5H2O、0.48 g/Lを0.1 M HClに溶解しました。 滅菌前に、MM の pH を 6.8 に調整しました。 CPKO、ヘキサン酸ナトリウム、および CaCl2 を個別に 121 °C で 20 分間滅菌しました。 一方、尿素およびTE溶液は0.2μm滅菌膜フィルターを使用して濾過し、必要な濃度で滅菌培地に添加した。 C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp の P(3HB-co-3HHx) 生合成を、200 rpm で振盪しながら 30 °C で 48 時間実行しました。

細菌細胞を、8,000 rpm、4 °C で 10 分間の遠心分離によって収集しました。 その後、細胞ペレットを蒸留水（DW）で洗浄し、続いてDWとヘキサンの1:1混合溶液で洗浄して油状残留物を除去した。 次に、細胞ペレットを DW で再洗浄してヘキサン残留物を除去し、事前に秤量したビジューボトルに移しました。 次に、細菌細胞ペレットが入ったボトルを-20℃で一晩凍結し、完全に乾燥するまで凍結乾燥機を使用して凍結乾燥しました。 最後に、凍結乾燥した細胞の重量をg/Lで記録した。 同時に、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により、ＰＨＡ含有量およびモノマー組成を調べた。

RSM は実用的なモデリング手法であり、実験を作成し、影響プロセス変数を最適化するための統計的および数学的ツールのセットです60。 この研究では、中央複合設計 (CCD) に基づく RSM を使用して、P(3HB-co-3HHx) コポリマーの生産が強化されました。 これは、実験の完全な要因計画を行わずに、応答変数の 2 次多項式を構築するために一般的に使用されます。

この研究では 3 つの重要な要素、すなわち CPKO (g/L) (X1)、ヘキサン酸ナトリウム (g/L) (X2)、および培養時間 (h) (X3) を使用しました。 各変数は、CCD 設計に基づいて 5 つのレベル (1.68、1、0、+ 1、および + 1.68) でコード化され、最適領域の応答曲面の特性を定義します。 合計 20 回の発酵実行が式 1 に従って設計されました。 (1)、中心点での 5 つの反復発酵実行を含む。

ここで、k は独立変数の数、n0 は中心点での実験の繰り返し数です。

重要因子のコード化されたレベルと実際のレベルを表 3 に示します。テストされた発酵実行の計画マトリックスを表 1 に示します。平均値は 3 回の実験実行から報告されました。 結果の統計分析には、Design-Expert v7.0.0 ソフトウェア (Stat-Ease, Inc.、ミネソタ州、米国) を使用しました。 CCD 設計の実験結果は、式 1 に示すように、重回帰技術によって 2 次多項式に当てはめられました。 (2)。

ここで、Y は予測測定応答です。 Xi と Xj は独立変数です。 β0 は切片を表します。 βi、βii、βlj はモデルの回帰係数です61。 3 つの独立変数に対して生成されたモデルを式 1 に示します。 (3)。

ここで、Y は P(3HB-co-3HHx) 生成の予測応答 (g/L) です。 β1、β2、β3 は線形係数です。 β11、β22、β33 は 2 次係数を表します。 β12、β13、β23 は相互作用係数です。 X1、X2、および X3 は、CPKO (X1)、ヘキサン酸ナトリウム (X2)、および培養時間 (X3) のコード化された値を表します。

試験された 3 つの因子、CPKO、ヘキサン酸ナトリウム、および培養時間の値は、振盪中の C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp による P(3HB-co-3HHx) 生成を検証するために設計空間からランダムに選択されました。フラスコモデル。 この実験では、培地の他の成分は固定レベルでした。

発酵は、C. necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp による P(3HB-co-3HHx) の生成を向上させるために、10 L 撹拌タンク バイオリアクター (モデルMDFT-N-10L、丸菱、日本) で実行されました。 3% v/v の細菌接種材料を、6 L の最適化培地を含むバイオリアクターに移しました。 バッチ培養は、初期 pH および撹拌速度それぞれ 6.8 rpm および 200 rpm で 30 °C で実行されました。 発酵中、培養ブロスのpHは、pHコントローラーを使用してHPO3またはNaOHを添加することによりpH6.8に維持した。 空気流量は 0.25 vvm に固定されました。 細胞バイオマスと P(3HB-co-3HHx) 生成を、48 時間の発酵中 6 時間ごとに評価しました。 発酵は３回行い、平均値を求めた。

10 g の凍結乾燥細胞を 1 L のクロロホルムに溶解し、室温で 3 ～ 5 日間撹拌して P(3HB-co-3HHx) コポリマーを抽出しました。 次に、濾紙（Whatman No.1）を用いて細菌細胞懸濁液を濾過することにより細胞破片を除去した。 その後、ロータリーエバポレーターを用いて、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）溶解クロロホルム溶液を約１００ｍＬまで蒸発させた。 続いて、蒸発した溶液を１００ｍＬの氷冷メタノールに一滴ずつ添加し、１時間撹拌した。 最後に、精製されたポリマーは、0.45 μm PTFE 膜を使用した濾過によって分離され、さらなる実験に使用される前に 3 ～ 5 日間風乾されました 44。

プロトン核磁気共鳴 (1H NMR) 分光法は、PHA ポリマー組成を調査するための簡単な技術です。 この研究では、精製した P(3HB-co-3HHx) コポリマーを 25 mg/mL で重水素化クロロホルム (CDCl3) に溶解し、NMR 分析に適用しました。 溶液状態の 1H NMR は、500 MHz で共振する Jeol JNM-ECZ-400R/S1 分光光度計 (日本電子株式会社、東京、日本) で実行されました。 化学シフトはテトラメチルシラン (TMS) を参照しました。 同時に、アダマンタンを外部標準として使用しました。

精製された P(3HB-co-3HHx) コポリマーの官能基は、フーリエ変換 IR (FTIR) 分光法によって検出されました。 FTIR 分析は、FTIR 分光計 (Thermo Scientific Nicolet IR200、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して実行されました。 128 回のスキャンは減衰全反射 (ATR) モードで構成されました。 さらに、スペクトルは 4000 ～ 400 cm-1 の範囲で 4 cm-1 の分解能で達成されました。

精製された P(3HB-co-3HHx) コポリマーの熱特性を、示差走査熱量分析 (DSC) および熱重量分析 (TGA) を使用して分析しました。 DSC 分析は、窒素流量 30 mL/min を使用して DSC25 (TA 機器、ニューキャッスル、デラウェア州、米国) によって分析しました。 約 3 ～ 5 mg の精製 P(3HB-co-3HHx) コポリマーを Tzero アルミニウム密閉パンに充填し、蓋をし、15 °C/分の加熱速度で 25 ～ 200 °C まで加熱しました。 次に、融解したサンプルを 200 °C で 2 分間維持し、-40 °C まで急速に下げました。 最後に、加熱速度 15 °C/min で -40 °C から 200 °C まで繰り返し加熱しました。 DSC サーモグラムから融解温度 (Tm)、結晶化温度 (Tc)、およびガラス転移温度 (Tg) を検出および分析しました。 TGA 分析では、約 5 mg の精製 P(3HB-co-3HHx) コポリマーをアルミニウム パンに充填し、Pyris 1 TGA 装置 (Perkin Elmer、米国) を使用して分析しました。 加熱温度は窒素雰囲気下、昇温速度２０℃／分で３０～９００℃とした。

DCW の決定は Trakunjae et al.24 から変更されました。 簡単に説明すると、1 mL の細胞培養懸濁液をあらかじめ秤量したエッペンドルフ チューブに移し、8,000 rpm で 10 分間遠心分離しました。 次に、回収した菌体を蒸留水で洗浄し、続いてＤＷとヘキサンの１：１混合溶液で洗浄して油状残留物を除去した。 次に、DWで洗浄してヘキサン残留物を除去し、8,000 rpmで10分間遠心分離しました。 次に、得られた細胞ペレットを-20℃で一晩凍結し、凍結乾燥機を使用して2〜3日間凍結乾燥しました。 最後に、凍結乾燥細胞を含むエッペンドルフチューブの重量を量って安定性を確認し、DCW を g/L で計算しました。

PHA 含有量とモノマー組成は、Braunegg et al.62 に従ってメタノリシス技術を使用して分析されました。 簡単に説明すると、15 ～ 20 mg の凍結乾燥細胞を試験管に加え、続いて 2 mL のクロロホルムとメタノリシス溶液 (85% v/v メタノールと 15% w/v H2SO4 の混合物) を加えました。 チューブを 100 ℃ で 180 分間加熱し、その後室温で冷却しました。 その後、1 mL の DW をチューブに加え、ボルテックスミキサーを使用して 1 分間激しく混合しました。 最下層のクロロホルムに富む PHA を牧草ピペットを使用して収集しました。 次に、Na2SO4 を使用して残留水を除去します。 クロロホルムに富む PHA 溶液 500 mL と 0.2% (v/v) カプリル酸メチルエステル (CME) (内部標準) 500 mL の混合溶液を GC 分析用に調製しました。 分析は、Restek RTX-1 カラム (Restek、米国) および炎イオン化検出器 (FID) を備えた Shimadzu GC-2014 plus (島津、日本) を使用して実行されました。 調製したサンプル溶液 2.0 μL を GC 装置に注入しました。 窒素を GC 分析のキャリアガスとして使用しました。 さらに、インジェクターと検出器の温度はそれぞれ 270 °C と 280 °C に設定されました。

すべての実験データは平均値 ± 標準誤差として記述されました。 統計分析は、SPSS 統計 17.0 ソフトウェア (SPSS for Windows、SPSS Inc.、シカゴ、イリノイ州、米国) によって実行されました。 実験応答は、二元配置分散分析 (ANOVA) を使用して検査されました。 各モデル項の線形回帰係数、二次回帰係数、交互作用回帰係数は、確率 (P) < 0.05 で F 値を使用して計算されました。 さらに、多項式の各項の統計的有意性が分析され、すべての係数が Design-Expert® v7.0.0 ソフトウェア (Stat-Ease, Inc. ミネソタ州、米国) を使用して調査されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。 通信および資料のリクエストは、C. Trakunjae または P. Vaithanomsat に宛ててください。

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この研究は、カセサート大学研究開発研究所 (KURDI)、助成金番号 FF(KU)28.65 によって財政的に支援されました。

カセサート農業・農業産業製品改善研究所 (KAPI)、カセサート大学、バンコク、10900、タイ

チャナポーン トラクンジェ、アンティカ ブンデーン、ワラポーン アピワタナピワット、ポンピモン ジャンチャイ、ピラニー ヴァイタノムサット

エコバイオマテリアル研究室、生物科学部、Universiti Sains Malaysia USM、11800、ペナン、マレーシア

もうすぐ Zher Neoh & Kumar Sudesh

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概念化、執筆—原案作成、CT。 レビューと編集、CT、PV、KS。 プロジェクト運営、資金調達、PV、CT; 方法論とデータ分析、CT、SZN、AB、WA、および PJ すべての著者は、原稿の出版版を読み、同意しました。

ピラニー・ヴァイタノムサットへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Trakunjae、C.、Boondaeng、A.、Apiwantanapiwat、W. 他。 Cupriavidus necator PHB-4/pBBR_CnPro-phaCRp による P(3HB-co-3HHx) コポリマー生成の統計的最適化とその特性特性評価。 Sci Rep 13、9005 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36180-7

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受信日: 2023 年 2 月 14 日

受理日: 2023 年 5 月 29 日

公開日: 2023 年 6 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36180-7

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